Serumenzyme

1. Serumenzyme Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

2. Enzyme - Eigenschaften • Die Bestimmung von Enzymaktivitäten in Serum, Plasma oder Harn hat für die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen. • Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT (GPT) 100 µg/ Liter (Gesamteiweiß 60-80 g/l) • Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren – kommen in höheren Konzentrationen vor. • Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins Blut.

3. Enzyme - Eigenschaften • Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B. Thrombin, Plasmin, Cholinesterase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Abfall der Aktivität im Blut. • Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B. Pankreasamylase, -lipase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut. • Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle – z.B. LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.

4. Enzyme - Eigenschaften • Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird – z.B. CHE -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut sinkt. • Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird – z.B. CK -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut steigt.

5. Enzyme - Eigenschaften • Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor – das heißt, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor – z.B. Lactatdehydrogenaseoder LDH, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt. • Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das Herkunftsorgan herauszubekommen. • LDH-1 kommt überwiegend im Herzmuskelund Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor. • Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)

6. Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgänge im Körper widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des An- oder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhältnisvon Enzymen zueinander, gibt zusätzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie. Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden müssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren. Serumenzyme – Diagnostisches Nützen

7. Enzyme – Messung der Aktivität • Die Internationale Union für Biochemie (IUB) hat schon 1961 Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitäten erarbeitet. • Die Bedingungen für diese optimierten Methoden sind: • Optimaler pH-Wert • Definierte Temperatur d.h. 37 °C • Optimale Substratkonzentration • Optimale Coenzymkonzentration • Optimale Konzentration an Aktivatoren

8. Enzyme – Messung der Aktivität • Enzymaktivität wird in Einheiten/l (U/l) angegeben. • 1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivität, die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 µmol Substrat katalysiert. (Dies wird für Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen). • Die Messtemperatur ist 37 °C (definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur für 25 °C vorhanden!)

9. Enzyme - Nomenklatur • Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „Enzyme Nomenclature“ [1972] sowie dem „Enzyme Handbook“ und seinen „Supplements“ (Springer-Verlag). • Die EC-Nummer hat 4 Komponente: • Stelle 1 definiert die Funktion – z.B. 1 = Oxidoreduktasen • Stelle 2 definiert die Donorgruppe – z.B. 1 = CH-OH • Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe – z.B. 1 = NAD(P) • Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe. • Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase • Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)

10. Enzyme - Nomenklatur • Die Hauptgruppen von Enzymen sind: • 1.x.x.x – Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC 1.4.1.3, LDH: EC 1.1.1.27) • 2.x.x.x – Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC 2.3.2.2, ASAT/GOT: EC 2.6.1.1, ALAT/GPT: EC 2.6.1.2) • 3.x.x.x – Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase: EC 3.1.3.1, α-Amylase: EC 3.2.1.1, Lipase EC 3.1.1.3) • 4.x.x.x – Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1) • 5.x.x.x – Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat Isomerase: EC 5.3.1.9) • 6.x.x.x – Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoff-carboxylase: EC 6.3.4.6)

11. Enzyme – Messung der Aktivität • In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt für das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdünnungen und Umrechnung der Ergebnisse. • Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik);diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder Endpunktverfahren.

12. Enzyme – Berechnung der AktivitätBerechnung desmolaren Extinktionskoeffizienten -  • Die Konzentration der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung: • c = (ΔE / [ µmol* d]) • c= Konzentration der Substanz • ΔE = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch oder Bildung von NAD(P)H • d = Schichtdicke der Kuvette in cm •  µmol= spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient

13. Enzyme – Berechnung der Aktivität • Die Enzymaktivität entspricht der Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt während der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivitäts-bestimmung aus mehreren Messungen das durchschnittliche ΔΕ/Minute ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir: • Volumenaktivität = Δc / t = ΔE / (t*  µmol *d) µmol/min* ml Messlösung • Δc = Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt • t= Messzeit in Minuten

14. Enzyme – Berechnung der Aktivität • Ein Substratumsatz von 1 µmol/min = 1U. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das Volumen der Messlösung und das Probenvolumen zu berücksichtigen. • Volumenaktivität = ΔE * V/ (t*  µmol *d * v) U/ml • V = Volumen der Messlösung • v = Volumen, das in dem Test eingesetzten Probe • Da man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren. • Wird verdünntes Material eingesetzt, muss dies auch berücksichtigt werden.

15. Serumenzyme - Herkunft • Sekretionsenzyme – Cholinesterasen • Reaktion: Acylcholin + H2O  Cholin + R.COOH • Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt) und die Pseudocholinesterasen (CHE) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten. • Die Bestimmung von AChE hat – im Gegensatz zur CHE– so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE biologische Halbwertzeit im Serum beträgt ca. 10 Tage.

16. Cholinesterase – diagnostisches Nutzen • Aktivitätsänderungen bei der Cholinesterase: • Erhöhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frühform der alkoholischen Leberschädigung), funktionelle Hyperbilirubinämie, Hypertriglyceridämie, Adipositas, Diabetes mellitus. • Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikämie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anämien)

17. Weitere Serumenzyme – Beispiele und diagnostische Anwendung in der Gerinnung • Andere Enzyme mit Aktivität im Plasma sind die, die mit der Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehören u.a. Urokinase, Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die überwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die während des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden. • Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivität im Form von „globalen“ Tests, wie der Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der Quick-Wertwird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapieangewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (Normal: 70-130%).

18. Andere Globalteste (mit ähnlichen Abkürzungen!) sind: Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte partielle Thromboplastinzeit [aPTT] – Prüft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMW-Kininogen durch den Zusatz von Oberflächenaktivatoren, wie Kaolin. Plasma Thrombinzeit [PTZ] – Die PTZ wird eingesetzt, um ein Fibrinogenmangel zu prüfen. Serumenzyme – als Globalteste in der Gerinnung

19. Enzyme – Messung der AktivitätKinetisch-Optischer Test - IFCC Methode • Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Serum. • Reaktion: Lactat+ NAD+  Pyruvat + NADH + H+ • Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des CoenzymsNADHbei 339 nm im Spektralphotometer. • Als Substrat dient Lactat. • Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im Überschuss haben und einen anderen pH-Wert einstellen. • NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form • NADH – NAD reduzierte Form

20. Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion • Die Bestimmung des ASAT (GOT) im Serum • ASAT – Aspartat-Amino-Transferase • GOT – Glutamat-Oxalacetat-Transaminase • Reaktion: Enzym ASAT/GOT • L-Aspartat + α-Oxoglutarat L-Glutamat + Oxalacetat • Indikatorreaktion: Enzym/Malatdehydrogenase • Oxalacetat + NADH + H+  Malat – NAD+ • Messprinzip – Abnahme der Extinktion bei 334 nm (Oxydation des NADH)

21. Enzyme – Messung der AktivitätZusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion • Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum: • Reaktion: Enzym Creatinkinase • Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP • Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase • ATP+ D-Glucose  ADP + D-Glucose-6-Phosphat • Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase • G-6-P + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+ • Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm (Reduktion des NADP zu NADPH)

22. IFCC Methode – Creatin Kinase • Messbedingungen für die CK • Temperatur: 37,0 °C ± 0,1 °C • Wellenlänge: 339 nm ± 1 nm • Bandbreite:  2 nm • Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm • Inkubationszeit: 180 s • Verzögerungszeit: 120 s • Messinterval: 120 s • Anzahl der Messpunkte: mindestens 6

23. Enzyme – Messung der AktivitätVerfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren Lichtes • Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum: • Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP)  pNP + PO4 • pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10 • Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm) • Kontinuierliche (kinetische) Messung • Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 benötigt • EDTA- bzw. Citratplasma können, wegen ihrer komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.

24. Enzyme - Diagnostik • GPT / ALAT • Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt • GPT ist überwiegend im Zytoplasma der Leberparenchymzellen zu finden. • Wichtigster Leberzellnekroseparameter • in kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und Skelettmuskulatur • Störungen – Stark lipämische Seren können nicht analysiert werden. • Referenzbereiche: (37 °C) – m: <41; f: <31 U/l

25. Enzyme - Diagnostik • GOT / ASAT • Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt • GOT ist überwiegend in der Leber sowie im Herz- und Skelettmuskulatur zu finden • in kleinen Mengen auch im Gehirn • Wichtiger Leberzellnekroseparameter, in Verbindung mit der GPT Hinweis auf die Schwere der Leberzellschädigung. • Erhöhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und Muskeldystrophie. • Störungen – Stark lipämische Seren können nicht analysiert werden. • Referenzbereiche: (37 °C) – m: <38; f: <32 U/l

26. Enzyme - Diagnostik • Laktatdehydrogenase - LDH • LDH kommt in allen Geweben vor, wobei sich die höchste Aktivität in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und Leber findet • Aufgrund der fehlenden Organspezifität eignet sich die Gesamt-LDH allein nur wenig als diagnostischer Parameter. • LDH-1 als „Spätindikator“für einen Herzinfarkt • LDH erhöht bei: hämolytische Anämien, Lungenembolie Skelettmuskelerkrankungen • Leber und Gallenwegserkrankungen (LDH-5): akute Hepatitis, akute Parenchymzellschädigung durch Intoxicationen • Störungen – Hämolytische Seren können nicht analysiert werden. • IFCC Referenzmethode (37 °C) - m: <225; f: <215 U/l

27. Enzyme - Diagnostik • Glutamatdehydrogenase - GLDH • Wird zur Leber-Diagnostik eingesetzt, da GLDH ausschließlich intramitochondrial in Leber vorkommt. • Ein starker Anstieg der GLDH weist immer auf eine schwere Leberschädigung hin, insbesondere der zentroazinären Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber. • Reaktion: • α-Oxoglutarat + NADH + NH4 L-Glutamat + NAD+ + H2O • Referenzbereiche: (37 °C) – m: <6,4; f: <3,8 U/l

28. Enzyme - Diagnostik • Gamma-Glutamyltransferase – γGT • γGT findet sich in der Leber überwiegend in den kanalikulären Segmenten der Hepatozytenmembran und in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege. • γGT istein Leberzellnekrose- und Cholestaseparameter • Reaktion: • γ-Glutamyl-p-Nitroanilid (farblos) + Glycylglycin  γ-Glutamyl-Glycylglycid + p-Nitroanilin (gelb) (405 nm) • Referenzbereiche: (37 °C) – m: <49; f: <32 U/l

29. Enzyme - Diagnostik • Alkalische Phosphatase - AP • Cholestaseparameter und Knochenerkrankungen mit erhöhter Osteoblastenaktivität • Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die Aktivität im Normalserum ist hauptsächlich auf das Leber- und Knochenisoenzym zurückzuführen. • Störungen – nur Serum bzw. Heparinplasma, nicht Citrat und EDTA verwenden. • Referenzbereiche: (37 °C) – m: <270; f: <240 U/l. Kinder in Wachstumsalter haben höhere Werte (Knochenbau)

30. Enzyme - Diagnostik • Bei Cholestase steigen AP und -GT im Serum an. • erhöhte gesamt AP kommt auch bei andere Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhöhter Osteoblastenaktivität, Nierenerkrankungen, Rachitis, Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren. • -GT Erhöhungen im Serum sind bei etwa 95% aller Fälle durch eine hepatobiliären Erkrankung zustande gekommen. • -GT ist ein guter Marker für Alkoholabusus • Mäßig erhöhte -GT kommt bei einer chronisch aktiven Hepatitis, primär biliäre Zirrhose und chronische Pankreatitis vor.

31. De-Ritis Quotient =GOT/GPT - akute Virushepatitis: < 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend - chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1 - nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1 Quotient (GOT+GPT)/GLDH gilt als Maßstab für den Schweregrad der Hepatozytenschädigung. - < 20 bei schwerer Schädigung - 20 – 50 bei mäßiger Schädigung Bedeutung von Quotientenbildung

32. Bedeutung von Quotientenbildung • Beispiele von Quotienten bei einer Hepatitis-A • Typischer ikterischer Verlauf / cholestatischer Verlauf

33. Enzyme - Diagnostik • Creatinkinase - CK • CK kommt in hoher Aktivität in der Skelettmuskulatur, im Herzmuskel und im Gehirn • 3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp) und CK-BB (Gehirntyp) • Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse,Myositis,progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen) • Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt (Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis • Referenzbereiche: (37 °C) – m: <170; f: <145 U/l

34. Enzyme - Diagnostik beim Herzinfarkt • CK-MB erreicht im Myokard ihre höchste Konzentration • Obwohl CK-MB nicht vollständig kardiospezifisch ist, wird sie in Verbindung mit der Gesamt-CK neben den kardialen Troponinen weiterhin als biochemischer Marker für den akuten Herzinfarkt eingesetzt. • Cardiac-Troponin-T - Methode der Wahl, da standardisiert • Cardiac-Troponin-I • Troponin-Cist nicht spezifisch genug für die Herzinfarktdiagnostik. • CK,CK-MB und Troponin T steigen 2-6 h nach einem Infarkt. • Myoglobin nach 1-2 h; GOT nach 4-6 h; LDH-1 (HBDH) nach 6-12 h;

35. Serumenzyme – Referenzbereiche für gesunde Erwachsene – 37 °C • -GT – M: < 50 U/l;F: < 32 U/L (IFCC) • AP – M: 40-120 U/l;F: 30-90 U/L • GPT – M: < 40 U/L;F: < 33 U/L (IFCC mit P-5-P) • GOT – M: < 43 U/L;F: < 36 U/L (IFCC mit P-5-P) • CK – M: 24-207 U/L;F: 24-170 U/L (IFCC) • CK-MB – M: < 18 U/L;F: < 18 U/L • GLDH – M: < 6,7 U/L;F: < 4,8 U/L • LDH – M: 135-225 U/L;F: 135-215 U/L (IFCC) • LDH-1 (HBDH) – M: < 171 U/L; F: < 202 U/L • (Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: 455-75)