transgenoze a klonování živočichů

1. transgenoze a klonování živočichů

2. základní metody transformace živočišných buněk • Mikroinjekce – cizorodá DNA se přenáší do oplodněného vajíčka pomocí tenké skleněné kapiláry pod mikroskopem • mikroinjekce spermioidů • Injekce rekombinantními kmenovými buňkami • Lipofekce • Elektroporace • Retrovirální infekce – viz přednáška genové terapie

3. lipofekce • DNA se zabalí umělými lipidovými vezikuly (lipozomy) a přirozenou cestou je dopravená až do jádra • DNA je záporně nabitá • lipidové monomery jsou nabité kladně 3-dimethylamino-1,2-propanediol oleyl-toluensulfonát dioleyloxy(propyl)-N,N,N- trimetylamonium chlorid

4. lipofekce

5. lipofekce (snímky z elektronového mikroskopu) liposom DNA komplex

6. liposomy mohou sloužit jako tkáňově (tumor) specifické transportery DNA nové přístupy: zacílení na specifické buňky, do struktury liposomů se zabudují protilátky specifické na dané buňky

7. mikroinjekce

8. mikroinjekce • transgen je vložen do vhodného vektoru • a) rekombinační vektor (virový vektor) • b) transgen je vyštěpen • oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části a samičí pronucleus je lépe viditelný). • mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka pod mikroskopem • implantace vajíčka do náhradní matky. • embryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porod. • detekce potomka vykazující fenotyp transgenu • stále nejpoužívanější metoda, účinnost 1-5% • elektroporace – vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s DNA elektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidů

9. mikroinjekce aaa aaa

10. modelový organismus – Xenopus laevis (drápatka vodní) • obrovská vajíčka umožňují velice snadnou mikroinjekci • zárodky (pulci) se vyvíjejí mimo tělo matky – velice snadné pozorování a manipulace • studium vývoje zárodku a zakládání orgánů (embryogeneze) • nevýhody: pomalý životní cyklus, tetraploidní genom

11. metallothionein promoter regulovaný těžkými kovy příklad mikroinjekce • krysí gen pro růstový hormon byl mikroinjekcí vpraven do myši • pod myším promotorem pro metallothionein, který je aktivován těžkými kovy • homozygotní linie byla vyselektována na potravě bohaté na těžké kovy • 10 týdnů staří sourozenci laboratorní myši (49 versus 29 gramů živé váhy)

12. příklad mikroinjekcetransgenní losos • gen pro růstový hormon z většího lososa mořského byl pod specifickým antifreeze promotorem vložen do menšího říčního lososa • fenotyp – ryba roste daleko rychleji a dosahuje dospělosti za polovinu doby než wild-typová ryba. pstruh • nebezpečí: transgenní ryba unikne ze sádek do volné přírody? • transgenní ryby mají výhodu při páření ale jsou méně zdatnější – evolučně velice nebezpečné – může zdecimovat veškerou populaci • řešení: sterilní ryby, nebo pěstování ve vnitrozemských sádkách

13. injekce kmenových buněk kmenové buňky – nediferenciované buňky, které se mohou diferenciovat v jakoukoliv jinou buňku (totipotentní) - mohou se kultivovat in vitro v nediferenciovaném stavu a snadno geneticky manipulovat, jsou nesmrtelné EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY odvozeny z vnitřních buněk embrya ve stavu blastocysty - jsou pluripotentní multipotentní

14. injekce kmenových buněk 1998 – zjištěno, jak se dají nekonečně dlouho množit in vitro a získat z abortovaných lidských embryí při umělém oplodnění (aktivní telomerasy) velice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají diferenciovat in vitro již byly připravena většina ze zhruba 250 typů savčích buněk (neurony, ganglia etc.) pro speciální účely mohou být kmenové buňky odvozeny i z dospělého jedince např. kmenové buňky z lidské kostní dřeně lze diferenciovat in vitro na prekurzorové buňky mozkové, jaterní či svalové), lze je však velmi těžce vyselektovat (u 40-letého jedince je to jedna buňka z 10 miliard) 2002 – kmenové buňky byly získány z odsátého tuku po liposukci, za 1500 dolarů navíc, je lze najít a uchovat do budoucna. 2004 – byly připraveny pluripotentní buňky ze zubní dřeně mléčných zubů 2005 – in vitro množené buňky obsahují množství letálních mutací signál

15. za prsní implantáty a Viagru se utrácí podstatně více peněz, než za výzkum Alzheimera. To znamená, že kolem roku 2030 zde bude široká důchodcovská populace s krásnými ňadry a obrovskými erekcemi, která si ale ani za boha nevzpomene, co s tím má dělat…

16. injekce kmenových buněk-vznik chimerické myši transformace selekce

17. injekce kmenových buněk-vznik chimerické myši normální blastocysta ICM (inner cell mass) injekce embryonální kmenové buňky vzniká chimerická myš tzn. že má část těla z buněk svých a část těla z buněk kmenových

18. mikrochimerismus u člověka

19. transformace kmenových buněk substituční vektor inserční vektor pozitivní selekce na neomycin (gen M)

20. Křížení – selekce transgenní myši tm = mutace (nebo nový gen) A – dominantní pro agouti srst X chimerický myšák normální myška ES blast barva srsti: agouti black black genotyp: AABB aaBB aaBB tm/+ES +B6 /+B6 +B6 /+B6 gamety: tm a +ES +B6 +B6 aB AB aB potomstvo F1: pokud je recesivní – bez projevu pokud je dominantní – část potomstva s projevem agouti agouti black AaBB AaBB aaBB tm/+B6 +ES/+B6 +B6/+B6

21. Křížení – selekce transgenní myši tm = mutace (nebo nový gen) potomstvo F2: X tm/+B6 tm/+B6 tm/tm tm/+B6 +B6/+B6 25% 50% 25% transgenní homozygot

22. knockoutovaná myš • gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru • gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu) do jeho ORF • transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu • vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky • selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu) inzerční vektor gen v genomu EKB Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 1 homologní rekombinace a přerušení genu

23. NeoR NeoR+/ HSVtk- NeoR+/ HSVtk+ knockoutovaná myš • PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen) • možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci • do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB také tento gen • selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk • náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají homologní rekombinace náhodná integrace linearizovaný substituční vektor NeoR HSVtk Gene segment 1 Gene segment 2

24. knockoutovaná myš-důležitý model pro testování funkce jednotlivých genů u obratlovců PROBLÉMY: 1)knockout zabíjí časné fáze embrya i když by neměl letální vliv na dospělého jedince. 2) nedostatečnost transgenní placenty – přenesení embrya do netransformované matky (část placenty vzniká z embrya) ŘEŠENÍ: PODMÍNĚNÝ KNOCKOUT Nobelova cena za medicínu 2007

25. podmíněný knockout • využívá rekombinasový systém P1 fága Cre –lox, • Cre-rekombinasa je specificky fungující enzym pro lox sekvence (34bp, sekvence mezi je tzv. floxovaná) • standardně jsou připraveny dvě linie transgenní myši pomocí kmenových buněk • první) je připravená homologní rekombinaci tak že má do sebe vložený požadovaný transgen (je stále funkční) floxovaný lox místy a geny pro selekci • druhá) je připravená náhodnou rekombinací a je do ní vložen gen pro Cre rekombinasu pod specifickým promotorem • a) tkáňově specifický • b) indukovatelný tetracyklinem • z obou linií se vyselektují • homozygoti • ti se zkříží • gen je knockoutován pouze • ve specifické tkáni • (místně) • nebo časově • po indukci tetracyklinem

26. problémy práce s embryonálními kmenovými buňkami • etické – v některých zemích je zákaz odvozovat a pracovat s EKB úplný zákaz: Německo, Rakousko, Francie, Švýcarsko, Norsko, Irsko, Polsko, Brazílie částečný: USA pouze linie odvozené do roku 2001, nesmí se derivovat nové volná manipulace: Japonsko, Kanada, Španělsko, Itálie, Finsko, Švédsko, Izrael, Singapur, Austrálie, ČR • imunologická inkompaktibilita vytvořené linie nejsou imunologicky kompatibilní s většinou pacientů kteří potřebují transplantaci • teratomy nediferenciované EKB tvoří často po implantaci do těla pacienta teratomy, pokusy s diferenciaci in vitro a až poté implantace • kmenové buňky dospělé špatná diferenciace, ale 100% imunologická kompaktibilita pokud jsou ze stejného jedince

27. řešení – vlastní embryonální buňky terapeutické klonování aneb přenos jader somatických buněk květen 2005 SCIENCE první úspěšné terapeutické klonování člověka ?? Woo-suk HWANG leden 2006 - skandál

28. využití kmenových buňek kmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do postižené tkáně (např. infarkt myokardu) • pokusy na myši u které byl uměle vyvolán infarkt prokazovaly, že kmenové buňky nejsou schopny diferenciovat po implantaci v srdeční buňky. • u některých myši se však funkce srdce zlepšila • kmenové buňky byly označeny GFP a sledovány po implantaci do myšího srdce, bylo zjištěno, že u některých myší se transformují v nové cévy a zlepšují tak prokrvení nemocného srdce. 2003 v Praze první pacient, kterému byly po těžkém infarktu myokardu implantovány vlastní kmenové buňky z kostní dřeně po zlepšení následovali další pacienti, u člověka se zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u myší. zatím však lidské kmenové buňky nemohou být nijak upravovány či značeny a tak se neví zda regenerace srdečního svalu pomocí kmenových buněk u lidí funguje jinak než u myší podobné pokusy probíhají v Německu a Holandsku

29. využití transgenních zvířat jako bioreaktory: domácí zvířata produkující mléko, do kterého je vylučován produkt transgenu. • gen je včleněn do genomu zvířete pod specifickým promotorem β-laktoglobulínu exprimujícím se v prsních žlázách • produkt transgenu neovlivňuje život transgenního zvířete • produkce lidských proteinu: inzulín, erytropoetin atd. • pavoučí mléko: fa NEXIA začala produkovat transgenní kozy exprimující geny pro produkci pavoučího proteinu, ze kterého pavouk vyrábí sítě do mléka • pavoučí vlákno je odolnější než ocel a používá se na výrobu neprůstřelných vest SPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILK

30. využití transgenních zvířat xenotransplantace: • prasata jsou nejvhodnější dárce, podobná velikost, podobný imunitní systém • v současné době se vyvíjejí prasata, která mají pozměněný imunitní systém, nebo modifikované povrchové proteiny buňky, tak aby je neodmítal lidský imunitní systém • např. inaktivace 1,3-galaktosyl transferasy, která přenáší galaktosu na povrch prasečích buněk a kterou rozpoznává lidský imunitní systém jako antigen • odstranění receptorů, které jsou důležité pro imunitní odpověď z prasečích buněk • 2003 - první nezdařené pokusy s transplantací srdce a ledvin pocházející z prasete • první úspěšný pokus: transplantace prasečích ostrůvkovitých buněk slinivky břišní, produkující lidský inzulín diabetikovi PROBLÉMY: etické, přenos prasečích virových onemocnění na lidi (endogenní retroviry), spousta „odpadních“ selat při selekci vhodného dárce

31. využití transgenních zvířat produkce „zdravých“ zvířat: • produkce drůbeže z masem, které má nižší obsah tuku • produkce vajec se sníženým obsahem cholesterolu atd. zvyšování odolnosti hospodářských zvířat proti nemocem

32. buněčné klonování zaškrcení embrya • nejstarší metoda klonování • i přirozeně (jednovaječná dvojčata, normální způsob u pásovců, vždy vznikají 4 stejné klony) • u člověka docházelo k deformaci jednoho embrya polyembryonie • partenogeneze • zárodek se vyvíjí z neoplodněného vajíčka vzniká pouze samičí potomstvo (haploidní jedinec) • zdařilé pokusy (i přirozeně u nižších živočichů, typické pro mravence) u savců se zatím nezdařila bez • deformací embrya • transplantace jádra • hlavní technika v současnosti používaná

33. denukleace transplantace jádra jádro z jedince který je klonován do bezjaderného vajíčka 1. denukleace hostitelské buňky chromozomy jsou jemně nasáty ostrou mikropipetou ze zralého neoplodněného vajíčka v metafázi II oocyt cytoplast 2. přenos jádra A. elektrofokusace – celá donorová (somatická) buňka dárce je elektroporována za zónu peliculu (vnější membrána oocytu) a fúzována s cytoplasmou hostitelského denukleovaného oocytu B. jaderná injekce – jádro somatické donorové buňky je mikroinjektováno do cytoplastu (honolulská metoda)

34. transplantace jádra elekroporace somatická buňka (kmenová buňka, tuková buňka, buňky pohlavních žláz, fibroblast, neuron) cytoplast

35. transplantace jádra jaderná injekce cytoplast tuková buňka z vaječníku a) disperzované tukové buňky b) jádra (šipky) nasáté do mikropipety c) propíchnutí zóny pelikuly d) zasunutí mikropipety až k oolemě e) aplikace piezo impulsu, který prolomí oolemu f) injekce jádra tukové buňky do ooplastu

36. transplantace jádra genetické přeprogramování je nutné pokud je jádro klonu vzato ze somatické buňky dospělého jedince “přeprogramování” – aktivace genomu dárcovské buňky k obnovení jeho totipotence tak, aby mohla nově vzniklá buňka se dělit a diferenciovat ve všechny další typy buněk celého organismu nejlépe k němu dochází právě v cytoplasmě denukleovaného oocytu přeprogramování

37. transplantace jádra vývoj embrya z buňky obsahující cizí jádro buňky po transformaci jsou pěstovány v médiu indukce embryogeneze chemicky: chlorid strontnatý implantace embrya embryo je ze živného roztoku chirurgicky přeneseno do dělohy vhodné náhradní matky vždy je vloženo několik embryí současně (malá pravděpodobnost uchycení)

38. buněčné klonování 1958 – první pokusy o klonování, vědci dokázali poprvé totipotenci buňěk

39. buněčné klonování 1986první klonovaný savec kráva byla naklonována z buněk časného stádia embryogeneze (nemá svůj jinak starý klon!) 1993 – telata byla získána jaderným přenosem z embryonálních kmenových buněk pěstovaných in vitro 1995 – dvě ovce Megan & Morag byly naklonovány z embryonálních buněk

40. příběh ovečky Dolly • 1996 - první savec naklonovaný ze somatické buňky • . • byly odebrány somatické buňky z prsní žlázy (vemeno) 6-leté ovce (genetická matka Dolly, plemeno Finn Dorset) • buňky byly přeneseny na vhodné médium in vitro a pěstovány • buňky pak byly na 5 dní přeneseny na médium bez živin aby přestaly růst (dostaly se do G0 fáze a zbavily se naprogramování na prsní žlázu) • každá z buněk pak byla elektroporačně zfúzována s denukleovaným ovčím oocytem ve stádiu metafáze II • zfúzovaná buňka byla přenesená zpět do živného média a chemicky bylo indukováno dělení a embryogeneze (SrCl2) • v 16-buněčném stádiu bylo embryo chirurgicky přeneseno do dělohy náhradní matky (plemeno Scotish blackface, skotská černohubka). • Dolly se narodila 5.6.1996 v Roslinově institutu ve Skotsku • Dolly má v podstatě tři matky – genetickou, tu co poskytla denukleované vajíčko a tu co ji donosila.

41. rodokmen Dollyiny rodiny

42. z Dollyina fotoalba Dolly a její „otec“ Ian Wilmut Dolly a její náhradní matka manžel Dolly beran David plemeno velšské horské Dolly s prvorozeným jehnětem Bonnie (13.4.1998) Dolly s třemi dalšími jehňaty (2xM a 1xŽ) 24.3.1999)

43. příběh ovečky Dolly úspěšnost klonování: • na přípravu Dolly bylo zfúzováno 277 denukleovaných jader s 277 somatickými buňkami • 29 embryií přežilo • 13 se úspěšně usadilo v dělohách náhradních matek • pouze jedna donosila živé jehně Dolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 let (průměrný věk ovce je 12) problém: ZKRÁCENÉ TELOMERY - bylo statisticky potvrzeno u Dolly vědci se přou o to zda Dolly vznikla opravdu ze somatické buňky nebo pouze z kmenové buňky přítomné ve vemeni mitochondriální DNA:obsahuje 37 genů většinou odpovědných za regulaci energetického metabolismu (dědí se v mateřské linii). Dolly mtDNA zdědila od druhé matky, která darovala vajíčko při přenosu somatické buňky dochází i k přenosu mtDNA první matky, ta je však ve vajíčku zničena, stejně jako mtDNA spermií u člověka je dědičně vrozená hluchota spojená s mutacemi na mtDNA

44. příběh ovečky Polly 1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen - narodila se také v Roslinově institutu ve Skotsku - byla naklonována z fibroblastu ovčího plodu, který byl in vitro geneticky modifikován - byl do něj vložen lidský gen pro alpha-1-antitrypsin pod promotorem s expresí do mléka - je to protein používaný pro terapii cystické fibrózy - ovce produkující další terapeuticky významné proteiny jsou na světě - jejích produktů se zatím nevyužívá protože je obava, že mohou mít chorobu svědivku, která může mít podobný základ jako BSE a u lidí vyvolávat Jacobs-Creutzveldovu chorobu

45. myš Cumulina a její sestry 1999první klonovaná myš z dospělé buňky na Honolulské Univerzitě na Hawaii z několika náhradních matek vzniklo 22 samičích klonů první generace, první myš byla pojmenována Cumulina z myší první generace byly odebrány somatické buňky a bylo vytvořeno 28 klonů druhé generace myši byly klonovány z tukové buňky vaječníku buňky nebyly fúzovány elektroporačně ale tzv. honolulskou technikou pomocí speciální mikropipety úspěšnost 2-4% tým se také pokoušel o naklonování myši z neuronu a poprvé se také pokusily vytvořit mužské klony ze Sertoliho buněk varlat - neúspěšně

46. XENA – první klonované sele 2000 v Roslinově ústavu se narodilo černé sele Xena bílé prasnici metoda použitá při klonování Dolly selhala a sele bylo získáno honolulskou technikou z buňky odebrané z měsíčního plodu úspěšnost: Xena vzešla ze 110 klonovaných vajíček, které byly implantovány do 4 náhradních matek Embryos clonally derived by microinjecting the nuclei of Meishan x Meishan breed (black coat) fetal fibroblasts into Landrace breed (white coat) enucleated oocytes. These embryos are at the four-cell stage after 40 hours of culture in vitro.

47. první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitou 2002 opět v Roslinově ústavu ve spolupráci s japonskou firmou PPL Therapeutics se narodilo prvních pět selat s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3- galaktosyltransferasu(nejsou to klony) 1,3- galaktosa na povrchu prasečích buněk způsobuje „hyperacute rejection“ –HAR při xenotransplantacích, což je rychlá humorálně imunitní odpověď lidského těla na prasečí buňky 2003 byly připraveny prasata s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3- galaktosyltransferasu a vloženým lidským genem pro alfa- 1,2- fukosyltransferasu, která se podílí na tvorbě univerzálně akceptovaného antigenu HT na povrchu buněk 2005 plánovány první transplantace prasečích srdcí, ledvin, slinivek, jater, kůží a krevních buněk z 1,3-GT knock-out HT transgeních prasat do lidí.

48. první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitou standardně byly připraveny selata overexprimující lidský gen pro alfa- 1,2- fukosylosyltransferasu a pomocí PCR byly vyselektováni z vrhu dva heterozygoti (samec a samice) a ti spáření dohromady samice byla ve 30 dnů těhotenství zabita a z jejího těla bylo odebráno 12 plodů, ze všech byla odstraněna hlava, končetiny a vnitřnosti a zbylá tkáň byla rozsekaná a kultivována na jednotlivé buňky buňky byly elektroporovány s linearizovaným vektorem nesoucí knock-outovaný gen pro 1,3 galaktosyl transferasu a dvojitě transgenní linie vyselektovány na neomycinu tyto buňky pak byly použity na přenos do denukleovaných oocytů honolulskou metodou HT+ HT-

49. první klonované kotě CC se narodilo 22 prosince 2001 v texaské firmě A&M na získání CC bylo použito 188 embryí CC není stejná jako Rainbow, barva srstí a její textura je částečně ovlivněna prostředím dělohy (fenomén inaktivace X-chromozomu) první pokus: byly použitý kožní buňky, jediná těhotná kočka nesoucí klon potratila ve 44 dnu CC byla připravena nakonec stejně jako Cumulina z tukové buňky vaječníku náhradní matka Rainbow genetická matka CopyCat

50. genetický dárce klony z katalogu firmy: gizmo malý gizmo používají novou metodu klonování: chromatinový transfer tahini baba nanusch a tabouli cena za jeden klon: 32 000 $ nicky malý nicky klonování psů komplikovanější: - nepravidelná a velmi řídká ovulace (nutnost udržovat velkou populaci náhradních matek) - vajíčka nedozrávají ve vaječnících ale až ve vejcovodech a proto je nelze jako u jiných savců získávat při sterilizaci zvířat (nutno operativně – drahé) - psí vajíčka jsou zakalené spoustou tuku a lze je těžko mikroskopicky denukleovat cena za uložení buněk z mrtvého či živého zvířete do banky : 850 $