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病原生物学教研室 Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University

医学微生物学 Medical Microbiology. 病原生物学教研室 Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University. 第八章 病原学诊断与防治. 第一节 细菌学诊断 第二节 病毒学诊断 第三节 真菌学诊断 第四节 特异性预防与治疗 ( 自学 ). 第一节 细菌学诊断. 细菌学诊断内容包括 : ◙ 查病原菌及其成分（抗原、产物、核酸） —— 细菌学诊断 （ bacteriological diagnosis ）

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病原生物学教研室 Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University

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Presentation Transcript

  1. 医学微生物学 Medical Microbiology 病原生物学教研室 Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University

  2. 第八章 病原学诊断与防治 第一节 细菌学诊断 第二节 病毒学诊断 第三节 真菌学诊断 第四节 特异性预防与治疗(自学)

  3. 第一节 细菌学诊断 细菌学诊断内容包括: ◙查病原菌及其成分（抗原、产物、核酸） ——细菌学诊断 （bacteriological diagnosis） ◙ 查特异性抗体 ——血清学诊断 （serological diagnosis）

  4. 一、病原菌检测 （一）标本采集与送检原则 ◙按疾病种类与病程采取不同标本 ◙无菌操作，防污染 ◙在发病早期与用药之前采取标本 ——对已使用抗菌药物的患者标 本，实验室要采取适当措施

  5. ◙快速、冷藏送检 ——对少数菌要保温送检（如脑膜炎球 菌、淋球菌等） ◙有特殊要求的细菌（如某些严格厌氧菌等） 必须在特殊条件下送检和保存。

  6. （二）检测方法 1、形态结构检查 2、分离培养鉴定 3、抗原检测 4、其他检测

  7. 1、形态结构检查 一般程序： 标本涂片 固定 染色 镜检 （观察镜下特征：菌体形态、排列、染色性 及特殊结构等） 初步鉴定 注：对形态、结构、排列方式和染色性无特征的细菌，直接涂片染色镜检无意义

  8. 主要技术 • （1）显微镜放大技术 • 普通光学显微镜 • 以可见光为光源 • 分辨率：0.25μm • 放大倍数：×1000

  9. B. 电子显微镜 以电子流代替光波， 电磁圈代替放大透镜 分辨率：1nm 放大倍数：×10万以上 电镜标本制作复杂，且必须真空干燥状态下观察 ——不能观察活的微生物

  10. C. 其他显微镜:适用不同观察目的 • 暗视野显微镜 • 相差显微镜 • 荧光显微镜 • 共聚焦显微镜

  11. （2）染色技术 细菌易与带正电荷的碱性染料结合而着色 简单染色法：只用一种染料，过程简单， 可观察菌体形态、排列方式 复合染色法：用二种或二种以上染料多步骤染 色，能反映菌体内部染色特征

  12. 革兰染色法：革兰阳性菌（紫色）、 革兰阴性菌（红色） 抗酸染色法： 抗酸阳性菌（红色）、 抗酸阴性菌（蓝色） 特殊染色法： 细菌荚膜、芽孢、鞭毛、 细胞壁、核质等染色

  13. 革兰阳性菌 (Gram positive bacteria) 革兰阴性菌 (Gram negative bacteria) 涂片 碘液媒染 酒精脱色 复红复染 结晶紫 染色 革兰氏染色法（Gram Stain） 由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。 1、步骤：

  14. 2、分离培养与鉴定 （isolation and identification） 一般程序： 培养特征： 生长条件 菌落特征 溶血环特征等 普通琼脂平板 血琼脂平板 选择培养基平板 标本（或增菌后） 接种 染色镜检： 根据形态特征初步鉴定 生化反应 ：如肠道杆菌的乳糖发酵试验

  15. 血清学鉴定：鉴定细菌的种、型 内、外毒素检测 动物试验：家兔、豚鼠等 毒力鉴定 纸片法：只可定性 试管法：可定量（测MBC、MIC） E-test： 可定量（只可测MIC） 药敏试验

  16. 3、抗原检测（detection of bacterial antigens） 用已知Ab检测待测Ag： 特点：特异性强、敏感性高，Ag的检出与病原菌的死活无关

  17. 4、其他检测： • 代谢产物的检测： 如气相色谱法鉴定厌氧细菌 • PCR检测核酸 • 基因芯片

  18. 二、血清学检测 用已知Ag测未知Ab 标本：血清和其他体液 诊断意义： 双份血清Ab效价4倍及4倍以上升高

  19. 常用方法： 凝集试验： Widal test——诊断伤寒、副伤寒 Well-Felix——诊断立克次体病 钩体的显微凝集试验 中和试验： 抗“O”试验 ELISA

  20. 第二节 病毒学诊断 电镜直接观察 光镜检查包含体 分离培养 病毒颗粒 病毒抗原 病毒核酸 病毒酶类：如逆转录酶 查病毒 病毒感染的 检测内容 查特异性Ab

  21. 一、标本采集与送检原则 ◙按疾病种类与病程采取不同标本 ◙无菌操作，标本用“双抗”或加两性霉素B 处理 ◙在发病早期与用药之前采取标本 ◙ 低温保存，快速送检，病变组织用50％ 甘油保存 ◙血清学检测采双份血清

  22. 二、病毒的分离与鉴定 一般程序： 动物接种 鸡胚培养 细胞培养 指标阳性 指标阴性 病毒鉴定 无菌处理 标本 盲传2－3代 指标阴性 病毒阴性

  23. （一）病毒分离培养方法 1、动物接种: 黑猩猩、猴、兔、鼠等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒

  24. 2、鸡胚培养: 优点：易管理, 不带微生物, 成本较低 缺点：操作程序复杂

  25. 3. 细胞培养 (1)原代和次代细胞培养 剪碎 蛋白酶 培养基 组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞 (原代细胞) 传代培养 单层细胞 (次代细胞培养)

  26. 病毒的细胞培养

  27. 特点: A. 对多种病毒敏感 B. 生长能力有限, 获取成本高 C. 可携带潜伏病毒

  28. (2)二倍体细胞培养 体外分裂50-100代仍保持二倍体染色体数目。 可用于病毒的分离和疫苗生产 特点: A. 对多种病毒敏感 B.不带异种蛋白(人源性) C. 不带病毒,无致瘤潜能 D. 可传代50代左右

  29. (3) 传代细胞培养 特点: A.对多种病毒敏感性高 B. 繁殖能力高,传代时间长 C. 有致癌危险，不能用于疫苗生产

  30. 1.细胞病变效应( cytopathic effect, CPE) (二) 病毒在细胞中增殖的指标 • 病毒感染细胞 • 发生形态改变 Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town)

  31. Cytopathic Effect （2）病毒感染细胞 与邻近细胞融合 Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom).

  32. Cytopathic Effect （3）形成包涵体（inclusion body）

  33. 2. 红细胞吸附（hemadsorption, HAd） 病毒包膜表面血凝素（HA）＋ RBC表面HA受体 Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet.

  34. 3. 干扰现象（interference） 风疹病毒＋人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（－） 埃可病毒＋人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（＋） CPE(-)——风疹病毒(+) 埃可病毒(-) CPE(+)——风疹病毒(-) 埃可病毒(+) 风疹病毒？ 埃可病毒 ＋人胚肾细胞 4. 细胞代谢改变： 病毒增殖，细胞代谢变慢，pH变化减慢

  35. (三) 病毒定量测定 血凝试验： 病毒总量（活病毒+死病毒） 蚀斑测定（plaque） ： ID50或TCID50 (50%组织细胞感染量)： 感染性病毒量

  36. 第三节 真菌学诊断 (一) 标本的采集 浅部感染真菌：表层皮损组织（用70％酒精消毒） 深部感染真菌：体液、分泌物、排泄物等 (二)检查与鉴定 1、直接镜检： 查孢子、菌丝 表层角质标本：用10％KOH微加热后镜检 体液、分泌物、排泄物： 离心后染色镜检

  37. 2、分离培养： 标本处理 沙氏培养基 大培养 小培养 菌落特征观察 观察菌丝 孢子特征 生化反应或 分子生物学技术 鉴定

  38. 3.动物试验 4.皮肤超敏反应试验 （三）真菌学快速诊断 检测真菌Ag 、 Ab 检测真菌核酸 检测真菌毒素

  39. DNA疫苗 重组载体疫苗 转基因植物疫苗 亚单位疫苗 合成疫苗 基因工程疫苗 第四节 特异性预防与治疗 一、人工主动免疫 用人工的方法将疫苗或类毒素等抗原性制剂 接种于人体，使机体获得特异性免疫力。用于预 防。 主要生物制品: 死疫苗 活疫苗 类毒素

  40. 死疫苗与活疫苗的比较

  41. 抗毒素 胎盘球蛋白 丙种球蛋白 抗菌血清 细胞免疫制剂 二、人工被动免疫 用人工的方法注射含有特异性抗体的免疫血清 、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力。用于应急性预防和治疗。 主要生物制品：

  42. 人工主动免疫与人工被动免疫的比较

  43. 三、细菌感染的治疗 • (一）抗菌药物的种类 • 生物来源分类：细菌、真菌、放线菌产 • 生的抗生素 • 按化学结构和性质分类 • ①β-内酰胺类 ④四环类 • ②大环内酯类 ⑤氯霉素 • ③氨基糖苷类 ⑥喹诺酮类、磺胺类

  44. （二）抗菌药物的主要作用机制 • 影响细胞壁合成: β-内酰胺类抗生素等。 • 影响细胞膜的功能：多黏菌素、两性霉素B等。 • 影响蛋白质的合成： • ①作用于核糖体30S亚基 • ②作用于核糖体50S亚基 • 影响核酸代谢

  45. 四、病毒感染的治疗 （一）抗病毒化学制剂 1.核苷类似物： ①无环鸟苷（阿昔洛伟）、丙氧鸟苷（庚昔洛伟）、喷昔洛伟：用于HSV感染引起的单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹。 ②阿糖腺苷：用于HSV、VZV、CMV、HBV感染及HSV引起的角膜炎。

  46. ③病毒唑（3’-氮唑核苷）：用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治疗。③病毒唑（3’-氮唑核苷）：用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治疗。 ④碘苷（疱疹净）：用于疱疹病毒引起的角膜炎。 ⑤叠氮胸苷 (Azidodeoxythymidine, AZT)、拉米夫啶：为HIV逆转录酶抑制剂。

  47. 核苷类药物的作用机制： ①抑制病毒基因复制： a.模拟核苷成分掺入病毒基因组； b.竞争病毒复制酶。 ②抑制病毒基因转录。

  48. 2.非核苷类逆转录酶抑制剂：奈非雷平 3．蛋白酶抑制剂：沙奎那韦瓦、英地那韦 4．其他：金刚烷胺、乙基金刚烷胺。 抑制病毒的穿入与脱壳。

  49. 干扰素 干扰素诱生剂 中草药 IL-12、TNF等

  50. (四)抗病毒基因治疗 • 反义寡核脱氧核酸（asODN） • 反义寡核苷酸（asON） • 核酶（ribozyme） • siRNA（small interfering RNA）

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