1 / 27

单克隆抗体制备

单克隆抗体制备. Monoclonal antibody 单个 B 淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗原决定簇的抗体。分三个阶段： （ 1 ）免疫 Balb/c 小鼠 （ 2 ）建立筛选方法和程序 （ 3 ）杂交瘤的生成. 一、动物免疫. 1 Balb/c 小鼠 6-8 周龄， 25g 左右，雌性较佳 2 免疫方法 （ 1 ）首次腹腔免疫 0.5 ml 抗原与福氏完全佐剂 1 ： 1 的混和液，一般 2-3 只鼠 （ 2 ） 30 天后加强免疫，用福氏不完全佐剂. （ 3 ） 15 天后，尾静脉注射 0.1mL 水剂抗原，免疫 3 天后，去脾脏融合

eli
Télécharger la présentation

单克隆抗体制备

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 单克隆抗体制备 Monoclonal antibody 单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗原决定簇的抗体。分三个阶段： （1）免疫Balb/c小鼠 （2）建立筛选方法和程序 （3）杂交瘤的生成

  2. 一、动物免疫 1 Balb/c小鼠 6-8周龄，25g左右，雌性较佳 2 免疫方法 （1）首次腹腔免疫0.5 ml抗原与福氏完全佐剂 1：1的混和液，一般2-3只鼠 （2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂

  3. （3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫 3天后，去脾脏融合 对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体 程序依抗原性质而定。

  4. 可溶性蛋白（提取或表达的蛋白） 50-100μg 颗粒性蛋白（病毒） 50-100μg 细菌 106CFU 活细胞 （哺乳动物细胞） 105-7CFU 活癌源细胞 104-6CFU 糖类（多糖、糖蛋白） 100-200μg 核酸 100-200μg

  5. 二、骨髓瘤细胞的培养 1 在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以 MEM培养基复苏，37℃ CO2培养箱中培养 2 在对数生长期收获107-108CFU的 SP2/0细胞 3 500 g离心5min，弃上清 4 轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20 mL MEM营养液中

  6. 注意要点： 1 如细胞外观不健康，或生长密度不好，应检测是否 有支原体污染 2 一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免长期培养 3 融合的细胞要处于对数生长期

  7. 三、饲养细胞的制备 1 取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min 2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入 小鼠腹腔

  8. 5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次， 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用 6 将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心 5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培 养瓶内待用

  9. 注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否 则会造成污染 3 如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的 位置，重新吸取细胞液

  10. 四、脾细胞的制备 1 取Balb/c小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min 2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔 4 小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培 养皿内

  11. 5 用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾 细胞分离出来 6 用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离 心管中，沉降5min 7 将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心 5min，弃上清，沉淀以20mL MEM培养基重悬

  12. 注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心， 不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破 3 如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好， 应选用备用小鼠的脾脏

  13. 五、细胞融合及培养 1 以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细 胞融合管中 2 在室温下500g离心10min，弃上清 3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置 37℃水浴 4 在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37℃ PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次

  14. 5 在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至 • 37℃的MEM培养基加至融合管中 • 37℃水浴5min • 室温下500g离心10min，弃上清 • 在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加入HAT培养基30mL，后加入10-15mL饲养细胞悬液

  15. 9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔2- 3滴，约0.1-0.15mL 10 将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2培养 箱中培养 11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况

  16. 12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上， 细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里 的抗体。

  17. 注意事项： 1 脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1— 5：1最好 2 细胞融合是关键步骤，避免用力吸打 3 细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括 细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去 4 换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸出或冲散

  18. 六、杂交瘤细胞的筛选 大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。

  19. 注意事项： 1 因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗体。如 单用酶标记抗IgG抗体，则IgM类单抗就不能被筛选出来。 2 阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次 3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗的方法最好

  20. 七、杂交瘤细胞克隆 在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。

  21. 1 在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲养细胞的96孔板 2 将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀 3 血液计数板计数 4 在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行10倍比稀释

  22. 5 当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至96孔板中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔 6将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2培养箱中培养10天左右，注意观察 7 大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7天换液一次， 8 10天左右克隆长满，可以检测上清

  23. 注意事项： 1 上清液要在24 h内测定 2 细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞为深蓝色，且没有光泽 3 如有高质量的FCS ，可不用饲养细胞 4 一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定 5 如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加1mol/mL的Cu SO4溶液

  24. 七、实验室规模抗体制备 体外上清液培养 1 杂交瘤细胞先在25mL 的细胞培养瓶中培养 2 细胞长满瓶底后转至50或100mL的细胞培养瓶中培养 3 当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的培养液，并重复收集上清2次 4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上清

  25. 体内生产腹水 1 正常培养杂交瘤细胞 2 饲养Balb/c小鼠，注射细胞一周前通过腹腔注射0.5mL降植烷 3 在细胞对数生长期收获细胞，并进行计数，将细胞数量以培养液调整至（2-10）×107CFU 4 小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，1-2周后发展成癌性腹水

  26. 5 用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠 可收集2-3次 6 腹水5000g离心10min，收集澄清的上清， 除去油脂 7 加入0.05%的叠氮钠，小量分装保存。长期 置-70℃保存；备用4 ℃保存

  27. 八、杂交瘤细胞的保存 1 培养杂交瘤细胞至对数生长期 2 弃去细胞培养上清，以Hanks液洗涤一次 3 弃去洗涤液，加入含10%DMSO、10%犊 牛血清的MEM培养基，吹打细胞 4 将细胞悬液加入细胞冻存管，每中等细胞培 养瓶分两管，先放-70℃冰箱冻30min，然后置液氮罐中保存

More Related