表观遗传学创新实验 5’- 氮胞苷处理水稻幼苗对基因组 DNA 甲基化的影响

1. 东北师范大学生物基础实验教学中心 表观遗传学创新实验5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组 DNA甲基化的影响 庞劲松 刘宝

2. 表观遗传学与DNA甲基化 • DNA甲基化作用 • DNA的甲基化及其方式 • DNA甲基化的生物学意义 • DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 • DNA胞嘧啶甲基化检测 • 检测方法：MSAP，bisulfite sequencing • 5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 • 实验目的 • 实验材料 • 仪器 • 试剂 • 实验方法 • 5’-氮胞苷处理水稻幼苗 • 植物基因组DNA的提取与纯化 • 基因组DNA酶切-连接接头 • PCR扩增：预扩增，选择性扩增 • PAGE电泳 • 预期实验结果 • 注意事项与建议 • 思考题 • 参考文献

3. 表观遗传学： • 不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。 • 表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。 • 表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。 • DNA甲基化： 在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。

4. DNA甲基化作用 • DNA甲基化的方式 • 胞嘧啶甲基化 • 腺嘌呤甲基化 在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化 图1 胞嘧啶甲基化过程 DAM (DNA腺嘌呤甲基转移酶) 识别回文序列GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸) 图2 腺嘌呤甲基化过程

5. DNA甲基化的生物学意义 • 影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录 图3 甲基化与基因沉默 • 参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态 • 提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型

6. DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 • 从头甲基化 (de novo methylation) • DNMT3a，DNMT3b • 在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。 • 维持甲基化 (maintenance methylation) • Met1，DNMT1 • 较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责 在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化 状态给新合成的DNA链上加上甲基。 图4 两种胞嘧啶甲基化方式

7. DNA胞嘧啶甲基化检测方法 • 使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性： • 甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) • 胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序： • 重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing) GCmTACT 重亚硫酸钠GCmTATT 测序 测序 • 此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等

8. MSAP • 用途： • 最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段 • 原理： • 利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。 • 甲基化状态分析： • 在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。 • 表1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果

9. MSAP流程： 提取基因组DNA （注意发育时期和成长状态相同） ………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC…… ………TAGGCCACCGAACGG CCTG…… Msp I 酶切+接头 Hap II酶切+接头 ATCC GGTGGCTTGCCm GGACATCC GGTGGCTTGCCmGGAC TAGG CCACCGAACGG CCTGTAGG CCACCGAACGG CCTG PCR PCR PAGE电泳 PAGE电泳 Msp I 5’ …CC(m)G G… 3’ 3’ …GG C(m)C… 5’ Hpa II 5’ …CCGG… 3’ 3’ …GGCC… 3’

10. 重亚硫酸盐测序 图5 重亚硫酸盐测序原理

11. 5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 • 实验目的 • 使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。 • 实验材料 • 水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare) 5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。

12. 所需仪器 • 离心机 PCR仪 气浴摇床 水浴摇床 植物生长箱 • 电泳仪 电泳槽 微量移液器 紫外分析仪 分析天平 图6 所需主要仪器

13. 试剂 • 植物基因组DNA改良CTAB提取液： • buffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA; • buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB; • buffer C: 5%N-lauroylsarcosine • PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O， • PCR引物 • 预扩增引物： H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´) EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´) • 选择性扩增引物： H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´ EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。 • 酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer • 接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ CATCTGACGCATGGTTAA HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’ AGTACTCAGGACGAGC • PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， • 银染固定/终止液 (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC ，用时，加入3ml 37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。 • 其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λ DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。

14. 实验方法 • 5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养 • (1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天） • (2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天） 图7 5’-氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）

15. 植物基因组DNA的提取与纯化 • 改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992) 不同处理的叶片1g 液氮中研磨成粉 转入50ml离心管 加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液) 65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟 加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟 4℃3000rpm离心10-15分钟 上层水相 加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底 DNA于70%乙醇中过夜。 DNA沉淀 （第十二天）

16. 风干DNA Genomic DNA 2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀 待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30 分钟以除去DNA中的RNA。 加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟 4℃3000rpm离心10-15分钟 DNA沉淀 70%乙醇过夜洗涤DNA 溶于DNA于200-500μl TE中 Genomic DNA溶液 0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker （未酶切的λDNA）估计其浓度。 调整DNA浓度，置於-20℃备用。

17. 基因组DNA酶切-连接接头 • 甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。 • 水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下： 表2 水稻MSAP限制性酶切、连接体系 • 混匀体系，37℃，6小时，8℃，4小时，4℃保存。 • 共四个处理组，即Nipponbare 25mg/mL处理组，Nipponbare 50mg/mL处理组，Nipponbare 100mg/mL处理组，Nipponbare对照组；每组分别用HapII/MspI酶切，共需切8管 （第十五天）

18. PCR扩增 • 预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)： 混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应： • PCR程序：94℃ 预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒, 共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。 • 根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。 表3 AFLP预扩PCR体系

19. 水稻AFLP选择性扩增体系如下： • 按以下参数进行PCR扩增反应： 94℃ 预变性2分钟, 94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，  55℃复性30秒，  72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。 （第十七天） 表4 AFLP选扩PCR体系

20. PAGE电泳 • 电泳装置图 • 玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。 自来水清洗 95％酒精擦两遍 硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面 5分钟后，95％酒精再擦两遍， 装板 灌胶 图8 PAGE电泳系统

21. 尿素-PAGE胶配制 灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。 • 电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16μL， 恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。 表5 PAGE胶配方 灌胶图 电泳图

22. 银染操作 • 电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将 附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇 20分钟，直至指示染料消失。 • 凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水 洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板 从水中取出后，竖起空水15秒。 • 染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。 • 凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。） • 终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。 • 固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。 （第十九天） 图9 PAGE胶银染

23. 预期实验结果 • 同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。 （第二十天） 图10 预期结果PAGE电泳图

24. 注意事项与建议 • 五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4℃保存，保存时间不宜超过半个月； • 丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；

25. 思考题 • 5’-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？ • MSAP的原理是什么？ • 如何分析MSAP电泳图？

26. 参考文献 • [1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40. • [2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496. • [3] Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158－163 • [4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.