第六章菌种的质检、保藏与复壮

第六章菌种的质检、保藏与复壮 山东教育学院生物科学与技术系李志香

第一节食用菌菌种质量基本标准 • 菌种质量的优劣是食用菌生产成败的关键，关系到亿万菇农的切身利益和菌种科研、生产部门的信誉，必须对菌种通过识别、鉴定、质检后方可投入生产。食用菌从业人员如果再不引起足够重视，加强理论学习并付之应用，会挫伤菇农的生产积极性，势必大大扼制该产业的健康、持续发展。菌种鉴定必须从形态、生理、栽培和经济效益等方面进行综合评价。

食用菌菌种质量基本标准 • 生产上认为最可靠的鉴定方法是进行目测和镜检，通过实际观察，主要鉴定菌种的种性、菌丝状态、杂菌、害虫、积水和菌丝自溶等六项检验项目，检验结果全部符合质量标准的为合格品，若其中有一项或多项不符合质量标准者，为等外品或不合格品。

一个符合标准的菌种应具备以下条件： • 1、用统一的或标准的菌种名称和编号。 • 2、经出菇试验验证，具有优良的品种特性。即：高产、优质、抗逆性强、生命力旺盛；适应当地气候特点和市场要求。 • 3、有标签，并注明名称、编号、种性介绍、生产厂家和生产日期。 • 4、名称与内容相符，标明是哪种菇即是哪种菇，标明是哪个品种即是哪个品种，标明是哪种特性即是哪种特性。

一个符合标准的菌种应具备以下条件： • 5、无侵染性杂菌污染，无虫、螨为害。 • 6、栽培用菌种的转代次数不超过8代(提纯复壮后获得的原始一级种为第一代)。 • 7、菌丝健壮。其标志是：齐(菌丝前端生长整齐)、白(菌丝具有本品种应有的浓白、白或灰白色)、浓(菌丝浓密)、匀(菌丝生长均匀一致)。 • 8、打开容器，有浓郁的菇香。 • 9、容器用棉塞封口的，棉塞要干燥、不松动、无杂菌污染。

（附）食用菌菌种中细菌霉菌及虫害检验 • 1 细菌的检验 • 1.1 眼看：除去外包装，借助放大镜，观察装有菌种的瓶、袋或试管中培养基（料）表面有无光滑、湿润的粘稠物，有无菌丝生长不均匀处。若出现上述两种情况之一，则可初步判断有细菌污染，继续1.3步骤，进行进一步确认。 • 1.2 鼻嗅：打开装有菌种的瓶、袋或试管盖（或棉塞），鼻嗅是否有酸、腥臭等难闻的气味。若出现上述情况，则可初步判断有细菌污染，继续1.3步骤，进行进一步确认。 • 1.3 培养：在无菌条件下，于装有菌种的瓶、袋或试管内上、中、下三个部位取大豆粒大小的菌种（在疑有污染发生处应重点取样。），接入装有10mL营养肉汤培养基的试管内（每个部位做3个重复，同时设3个不接种的试管为对照），在35℃～38℃条件下振荡培养18hr～24hr，观察培养液是否变混浊。培养液澄清，无细菌污染；培养液混浊，有细菌污染。

（附）食用菌菌种中细菌霉菌及虫害检验 • 2 霉菌的检验 • 2. 1眼看：观察装有菌种的瓶、袋或试管中培养基（料）表面有无菌丝生长不均匀处；观察在棉花塞、瓶颈交接处、菌棒接种口处或培养基面上有无与正常菌丝颜色不同的霉污色斑。 • 2.2镜检：在可疑色斑处取少量菌丝体制成玻片，于显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗，以确定是否杂菌。 • 2. 3培养：在无菌条件下，于瓶或试管内上、中、下三个部位取大豆粒大小的菌种（在疑有污染发生处应重点取样。），接在PDA平板上（每个部位做3个重复，同时设3个不接种的平板，3个接有未污染的正常菌丝的平板为对照），在25℃～28℃条件下倒置静培养3d ～ 5d，观察培养基表面菌丝生长情况，并与对照相比较（重点观察菌丝颜色、生长速度、菌落特征、有无孢子产生等）。若待测平板上长出的菌丝与对照完全相同，则可判断无杂菌污染；若不同，则可判断有杂菌污染。

（附）食用菌菌种中细菌霉菌及虫害检验 • 3 虫害的检验 • 3.1眼看：观察装有菌种的瓶、袋或试管中培养基（料）表面有无菌丝生长异常处（如菌丝生长不均匀或局部无菌丝生长等。）；从异常处取出少量培养料，放于白色搪瓷盘上，铺开，并用放大镜仔细观察，是否有蕈蚊、蝇等昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫的滋生情况存在。

一、菌种的识别与质量检测 • 菌种鉴定，包括两方面内容：一是经分离或引入的菌种是否为生产中所需要的菌种；二是识别已知菌种的优劣。鉴定的方法很多，但不尽完善，严格地说，要达到较理想的效果需从形态、生理、栽培和经济效益等方面进行综合检测和评价，但要完成各种指标，除了需掌握一定的基础知识和基本技术外，还需具备一定的仪器、设备及人力物力和时间。因此，一般基层菌种厂是难以开展和完成的。这里仅将几种常用、简便、易行的方法予以介绍，供学习和实践中参考。

1. 培养对象的识别 • 在菌种的分离制作和引入菌种过程中，菌种的混淆、差错，也是偶有发生的。如香菇栽培时，出现的却是成片优质高产的平菇；栽培黑木耳出耳时却是毛木耳等等，从而达不到栽培目的，失去了栽培意义。因此，对于初学者来说最好请有一定实践经验的菇农或专业工作者帮助选购，通过多次栽培很快就会掌握品种的特性。同时，根据食用菌菌丝生长的特征通过检索表，也可帮助识别常用的种类。

2.食、药用菌菌种菌丝生长状态 对几种商品化生产的食用菌菌种进行检索和识别。用下述方法能在较短的时间内鉴定出你所需要的菌种与发出菌种是否吻合一致。

平菇 • 菌丝洁白、浓密、粗壮、整齐、匍匐状、气生茵丝发达，爬壁能力强。无菌被、无原基、培养基不脱壁。菌丝上无暗红色水珠，接种块周围无菌丝稀疏区。菌丝生长速度快，适温6—8天长满试管斜面。镜检菌丝呈线状，透明，分枝能力强，菌苔表面平整或波纹状或接种块周围略凹

金针菇 菌丝白色或浅灰白色，细绒毛状，初期较蓬松，后期气生菌丝紧贴于培养基表面，爬壁慢。菌丝生长速度较快，适温10天长满斜面。分泌色素，使培养基呈淡黄色，菌丝易断裂成节孢子，有时产生粉孢子成串着生于菌丝上。低温贮存，有时在斜面上形成少量子实体。

鸡腿菇 菌丝浅灰自色，呈粗线条或棉絮状，生长旺盛。基内菌丝分泌色素，使斜面培养基颜色加深，部分呈黑褐色。菌丝生长速度较快，适温8天左右菌丝即可长满试管斜面。

灵芝平贴、菌苔较厚实、有或无白色结晶物。

黑木耳 整齐、有或无分生孢子，无或有褐色色素

猴头平贴、点片状或星芒状、基内菌丝丝状。

3.对峙反应（拮抗试验法） • 在异宗结合的食用菌中，同一种食有用菌，经分离或杂交，将选育出许多不同的菌株，有些菌株的菌丝在形态上很难区别，如不同编号的平菇菌种，都是白色绒毛状菌丝，镜检时均具有锁状联合等。在当前菌种管理工作尚不十分健全的情况下，“同名异种”、“异种同名“的现象经常发生。要识别异同，可采用“对峙反应”加以区分。

方法1 • 用1支20毫米×200毫米的无底试管，中央部位装入长5—7厘米的木屑麸糠培养基，两端填平并塞上棉塞，高压灭菌后，两端各接入受检的菌种1小块，25℃条件下培养，当两端菌丝往中央生长并接触后，把试管移至20℃，约300勒克司的漫射光条件下继续培养，观察菌丝接触区有无对峙反应。若无褐色的带线出现，表示2个受检菌株的基因极相似或相同，是相同的菌株，仅编号不同，即“同种异名”。如果受检菌株和别的菌株都形成带线，则表示受检菌株是新的菌株。

方法2 • 对峙反应也可用平皿板进行测试，方法是在无菌的PDA培养基平板上各接入2个或多个被检菌株的菌种，如上述条件下培养，观察菌丝相接触部分有无带线，以示相同或不同的基因型的菌株。

（二）菌种优劣的鉴别 • 取得了生产中需要的菌种后，还需进一步检验菌种质量的优劣。现将生产中常用的几种食用菌菌种，根据菌丝生长发育状况，识别其好差优劣。

（三）几种简易质检法 • 1、宏观检查法：在生产实践中，广大菇农和专业工作人员总结出“纯、正、壮、润、香”的质量检查方法。这种应用感官识别菌种优劣，是经验的总结，能快速、有效地鉴定出菌种的优劣。具体方法是：“纯”指菌种的纯度高，无杂菌感染，无斑块、无抑制线、无“退菌”、“断菌”现象等；“正”指菌丝无异常，具有亲本正宗的特征。诸如，菌丝纯白、有光泽，生长整齐，连结成块，具弹性等；“壮”指菌丝发育粗壮、生长势旺盛、分枝多而密，在培养基上恢复、定植、蔓延速度快；“润”指菌种含水量适中，基质湿润，与瓶壁紧贴，瓶颈有水珠，无干缩、松散现象；“香”指具品种特有香味，无霉变、腥臭、酸败气味。

2、显微镜检查 • 挑取少量菌丝，置载玻片中央的水滴上，用解剖针或接种针拨散，盖上盖玻片成为菌丝装片，也可加碘酒或美蓝等染色后进行镜检。若正常的菌丝一般具有透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合。异宗结合的食用菌，凡仅有单核菌丝，经扩制、培养均不会结菇，不宜作菌种用；双核菌丝中，锁状联合多而密，则结菇力强，一般可认为是好菌种。

3、菌丝长速测定 • 在适宜的条件下，若菌丝生长迅速、粗壮有力、浓密整齐，一般为优质菌种；而菌丝生长缓慢、中断或长速极快、稀疏无力、参差不齐和易枯黄萎缩，则为劣质菌种。测定菌丝生长速度，可在PDA平板中心接种培养，在一定时间内，如24小时或12小时，在菌丝生长的最先端用笔划线，标志每天的生长速度测量菌落两个直交直径，取其平均值。。同理，还可在原种、栽培种瓶（袋）壁上划线测定。

4、菌丝生长量测定 • 将等面积的菌苔接入无菌的液体培养基内，在相同的条件下，进行摇床振动培养，经过一定时间后，过滤收集菌丝，反复冲洗干净，分别置容器内，80—100℃烘箱中烘干至恒重，或在60℃较低温度下真空干燥，而后称重。凡菌丝增殖快、重量高的为优质菌株，而增殖慢、重量轻的为劣质菌株。

5、耐高温测试 • 如中低温菌种，可将母种置最适温度下培养，一周后取出换至30℃条件下培养，24小时后再放回最适温度下培养。经过如此偏高温度处理后，若菌丝仍健壮旺盛生长，则表明该菌株具有耐较高温的优良性状；如果菌丝生长缓慢，出现发黄倒伏，萎缩无力，则为不良菌株。

6、纯度和长势测定 • 锥形瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察，若有气泡和菌膜发生，并具酸败味，说明菌种不纯，混有杂菌；如果无上述现象则菌种纯净无杂。再观察浮在液面的菌种，如果菌丝向旁边迅速生长、健壮有力、边缘整齐，且不断增厚，说明该菌株生长势强；若表面生长慢、稀疏、菌丝层薄，说明长势弱，不宜用于生产。

7、出菇试验 • 对引进或分离的菌种进行出菇试验必须在各级菌种的培养基成分、培养温度、培养时间及栽培条件基本一致的情况下进行，这是食用菌菌种工作者必须掌握的。出菇试验可按各种菇类的常规栽培方法进行，数量可少些。为使试验准确，减少误差，每一菌株设3～4个重复，以相同的措施管理，在管理过程中要详细记录。以香菇为例记载内容如下：

香菇出菇试验 • 第一，母种中菌丝生长情况，菌丝浓淡，生长快慢，菌苔韧性等。 • 第二，原种栽培种中菌丝生长情况，如菌丝萌动、吃料、生长快慢；菌种表面有无菌皮或菌皮厚薄，白色颗粒状物有无或多少；培养基转色情况等。 • 第三，栽培阶段，以人造菇木栽培为例应记载：菇木转色快慢、颜色深浅；出菇快慢、菇生长密度；子实体经济性状，包括菇的大小、厚度、色泽、圆整程度、菌柄长度、粗细等；转潮快慢；对水分的敏感程度；产量及产量分布；出口菇比例。 • 通过对记载资料分析，选出综合性状符合要求的菌株，供大面积生产或出售用。

8、抗霉性测定 • 1．制备菌种：把若干菌株编号，在同等条件下制备菌种，观察记载菌株成品率，成品率高者为抗霉能力强的菌株。 • 2．平板法测定：（以木耳为例）制备平板。在平板的一边分别接入不同的木耳菌株，每一菌株3个重复，在26～28℃下培养。待木耳菌丝长到平板一半左右时，在平板的另一边接上木霉菌丝，继续培养。之后注意观察木霉菌丝与木耳菌丝的交界处，出现拮抗线的表示木耳抗霉能力强，木霉菌丝无法长过去，为抗霉能力强的菌株；如果木霉菌丝很快盖过木耳菌丝，说明这个木耳菌株的抗霉能力差或没有抗霉力。

（四）栽培指标 • 这是菌种质量鉴定最可靠的方法。它是采用一定的栽培规模，通过不同地区、不同原料、不同栽培方式，进行多次反复栽培观察，详细记录和考种、评比后，凡具有优质、高产、高抗、高效和遗传性稳定性强的菌株，才是优质和可推广应用的品种。其鉴定的内容、方法和指标有：

1、成活率 • 将菌种接在适宜的培养基上，若菌丝能很快恢复、定植和蔓延生长，成活率很高，是好的菌种；反之，接种后恢复慢，成活率不高是质量差的菌种。

2、出菇快慢 • 一般说，高温型的出菇快，低温型的出菇慢，中温型的介于两者之间。而以菇的质量来说，高温型的质量差，低温型的质量好。但在同一温型食用菌品种的不同菌株，其菌种接后若菌丝分解培养料能力强，培养前后培养料失重大，出菇快而多，总产高，即是好菌种，否则为劣质菌种。

3、菇峰间隔 • 在一个生产周期中，子实体发生可分数批次或数潮次，产菇最多时称菇峰，最低时称菇谷，每个菇峰和菇谷构成一潮菇。凡菇潮多，间隔时间短，说明菌丝分解能力强，供子实体发生的养分积累多，因此转潮快，是好的菌种；反之，菇潮间隔时间长，或不明显，零星出菇，产量低，即为劣质菌种。

4、干燥率 • 鲜菇经干制后干燥率高，说明转化率高，子实体含水分低，为优质菌种。

5、生产效率 • 即生物学效率，指每100千克干料可产多少千克鲜菇。生物学效率高，则菌种质量好，反之为劣质菌种。

（五）经济指标 • 高产不一定高效、丰产不等于丰收，要占领市场，获得较高利润，还必须具备商品的要求。诸如，产品的色、香、味、形，档次，上市时间，保持期等。凡是鲜菇上市时间早，又时间长，产量高、品质好、档次高、含水量低，不易变色、变质、破碎、失重，无农药残毒、残臭，符合食品卫生标准和得到的利润高等，均表示经济指标高，则为优质菌株；而上市有效时间短，易变色、变味、变质，含水量高，失水严重，易破碎，利润低的菌种均为劣质菌种。

第二节菌种的复壮与纯化 • 一、菌种的退化原因和复壮措施 • 优良菌种的种性不是永恒的，它是可变的，变异是所有生物包括食用菌在内的普遍属性。在菌种传代过程中，往往会发现，某些原来优良的性状渐渐消失或变坏了，出现长势差、出菇迟、产量不高、质量不好等现象。这些现象人们泛称为“退化”。

(一)菌种退化的原因（1） • 1．可能是由于菌种的遗传性造成的(内因)，即原种菌系不好。同时，许多食用菌是容易杂交的，而现在的菌种又多是杂合性的，它的细胞核是杂合的，在遗传性上会出现分离。。 • 2．菌种可能被病毒寄生。

(一)菌种退化的原因（2） • 3．可能是在人工培养条件下，由于培养条件不适合(外因)，其中包括营养、温度、湿度，pH值、杂菌感染等，不能满足它的生理要求，使食用菌失去自我调节的能力，以至暂时失去正常的生理功能，不能表现优良种性。 • 4、就某一菌株而言，随着培养和使用时间的延长，个体的菌龄越来越大，新陈代谢机能逐渐减低，失去抗逆能力，或失去高产性状，以至失去其使用价值。

菌种退化的原因（总结） • 由此可见，菌种的所谓“退化”，是在传种继代过程中，从量变到质变的渐变结果。也是一种病态和衰老的综合表现。菌种既然可以衰老和“退化”，我们就应该一方面用妥善的保藏方法去延缓或遏制菌种迅速老化和变异，另一方面是给予适宜的环境条件，使其“返老还童”，恢复原来的生活力和优良种性，达到复壮目的。

(二)菌种复壮的措施（1） • 1．在菌种的培养、继代过程中，配制营养成分丰富的培养基，使其生长健壮，每隔一个时期，注意调换不同成分的培养成分(改变、调整、增加某种碳源、氮源或矿质元素等)，或直接转到适生段木上去，并给予适宜的环境条件。此法对因营养基质不适的衰老菌种，有一定的复壮作用。

(二)菌种复壮的措施（2） • 2．菌种分离，要有计划的把无性繁殖和有性繁殖的方法交替使用。在自然条件下，菌种的复壮，只有靠产生新一代才能实现，反复进行无性繁殖是会不断衰老的。经有性繁殖所产生的孢子，是食用菌生活史的起点，具有丰富的遗传特性。因此用有性繁殖的方法获得的菌株，再以无性繁殖的方法保持它的优良性状可使菌种的变异和遗传朝着对人们有利的方向发展。菌种的组织分离最好每年进行一次,3年进行一次有性繁殖。

(二)菌种复壮的措施（3） • 3．经过分离提纯的原种，适当多贮存一些，妥善保藏。分次使用，转管移植次数不要过多，避免带来杂菌或病毒污染，以致削弱菌种的生活力。

(二)菌种复壮的措施（4） • 4．银耳菌种出耳率降低，可加入芽孢进行复壮。方法如下，用30—40支银耳斜面芽孢试管，配500ML营养液(500ML净水+5g葡萄糖+乳酸数滴，使pH值5．5左右)，经灭菌后，将营养液用无菌长吸管注入芽孢试管，将芽孢菌落全部洗脱，装入无菌小口瓶，即配成孢子液，孢子液要随配随用，每瓶木屑菌种注入孢子液20ml即可，用于段木接种，出耳率明显提高。

(二)菌种复壮的措施（5） • 5．在高温夏季，培育蘑菇、凤尾菇等食用菌原种时，在琼脂培养基中加入适量微生素E有廷缓细胞衰老的作用，产量还有增加的趋势。每支试管培养基加1粒维生素E胶丸，灭菌后接种。蘑菇菌种在28℃下，经20天不出现黄菌丝，无菌丝倒伏，萎缩现象发生。

第三节菌种保藏方法 • 一、菌种保藏方法 • 食用菌菌种是从事科研和生产的重要资源，它和其他生物一样，具有遗传性和变异性。人们希望一个具有优良性状的菌种能通过保藏，使它的性状保持不变或尽可能地少变慢变。 • 目前对菌种资源采用的保藏方法有如下几种：

一、液氮超低温保藏法 • 本法是将要保藏的菌种密封在有保护剂的安瓿里，经控制速度预冻，再置于-150～-196℃液态氮超低温冰箱中保存。其原理是采用超低温手段，使生物的代谢水平降低到最低限度，在此条件下保藏，能保持其性状基本上不发生变异。

（－）菌种制备 • 1.培养基：采用马铃薯葡萄糖酵母琼脂培养基（PDYA）。配方：马铃薯（去皮）200克、葡萄糖20克，酵母膏1.5克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000亳升。 • 2.菌丝体菌种：可用试管斜面或平板法培养菌丝体，也可用麦粒菌种或液体培养的菌丝球进行保藏。 • 3.孢子菌种：采用常规方法收集孢子，然后制成孢子悬浮液保藏。

（二）保护剂 • 冷冻保护剂可用10%（体积比）甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液。

第六章 菌种的质检、保藏与复壮