1 / 67

TRANSKRYPCJA U EUKARYOTA

TRANSKRYPCJA U EUKARYOTA. U Eukaryota występują trzy polimerazy RNA: I, II, III. Eukariotyczny promotor. Liczby oznaczają % sekwencji, w których dany nukleotyd występuje w danej pozycji. wg innych: T A T A W A A R (W = A lub T; R – puryna).

erica-langley
Télécharger la présentation

TRANSKRYPCJA U EUKARYOTA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. TRANSKRYPCJA U EUKARYOTA U Eukaryota występują trzy polimerazy RNA: I, II, III

  2. Eukariotyczny promotor Liczby oznaczają % sekwencji, w których dany nukleotyd występuje w danej pozycji wg innych: T A T A W A A R (W = A lub T; R – puryna)

  3. Ponieważ, pomiędzy sekwencją TATA a miejscem startu jest bardzo różna odległość (-25 do -100 pz) można przypuszczać, że samo miejsce startu też się wyróżnia jakąś konkretną sekwencją. Sekwencja konsensusowa miejsca startu (inicjator, INR) u człowieka to: 5’ - Y Y A N W Y Y - 3’ pierwszy nukleotyd ulegający transkrypcji (A - pierwszy nukleotyd w pre-mRNA) Y = T lub C; W = T lub A

  4. TYLKO 24% promotorów zawiera kasetę TATA. TYLKO 46% promotorów zawiera sekwencję INR a spośród nich 35% ma kasetę TATA. • większość genów niemających kasety TATA należy do tzw. „housekeeping genes” – czyli genów podstawowego metabolizmu; • większość genów, które mają kasetę TATA charakteryzuje się regulowaną ekspresją • minimalny inicjator – YR (pirymidyna a następnie puryna jako • pierwszy nukleotyd ulegający transkrypcji

  5. Ważniejsze elementy promotora eukariotycznego BREu - TFIIBrecognition element – upstream BREd - TFIIBrecognition element – downstream MTE - motif ten element DPE - downstream core promoter element

  6. Polimeraza RNA II • Kompleks 12 podjednostek (RPB 1-11, RBC 10) • Łączna masa cząsteczkowa – ok. 600 kDa • Ale to nie polimeraza rozpoznaje promotory genów

  7. Podjednostki polimerazy RNA II (u człowieka) Na żółto zaznaczono podjednostki wspólne dla wszystkich trzech polimeraz RNA. Polimeraza RNA I – 14 podjednostek (białka RPA) Polimeraza RNA III –15 podjednostek (białka RPC)

  8. Polimeraza RNA II C-koniec www.steve.ab.com/science/transcription.html

  9. W skład kompleksu inicjującego transkrypcję wchodzą powszechne (podstawowe) czynniki transkrypcyjne (ang. general (basic) transcription factors). Nazewnictwo podstawowych czynników transkrypcyjnych TFIIA transcription factor kolejny czynnik z którą polimerazą współdziała

  10. INICJACJA TRANSKRYPCJI • TFIID łączy się z DNA. • TFIID składa się z kilkunastu • podjednostek. • Jedną z nich jest białko TBP • (białko wiążące kasetę TATA). • TBP rozpoznaje kasetę TATA • i wiąże się z nią z wysokim • powinowactwem. TBP – (ang. TATA-box binding protein). Pozostałe podjednostki nazywają się TAF (ang. TBP-associated factors)

  11. Kompleks TBP z DNA Molecular Biology of the Cell Alberts et al., 2002 Związanie TBP do małego rowka wywołuje w DNA duże zmiany konformacyjne  rozplecenie i zagięcie.

  12. TBP – białko wiążące kasetę TATA (ang. TATA-box binding protein) Ciekawostka: N-MDQNNSLPPYAQGLASPQGAMTPGIPIFSPMMPYGTGLTPQPIQNTNSLSILEEQQR QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQAVAAAAVQQSTSQQATQGTSGQAPQLFHSQTLTTAPLPGTTPLYPSPMTPMTPITPATPASESSGIVPQLQNIVSTVNLGCKLDLKTIALRARNAEYNPKRFAAVIMRIREPRTTALIFSSGKMVCTGAKSEEQSRLAARKYARVVQKLGFPAKFLDFKIQNMVGSCDVKFPIRLEGLVLTHQQFSSYEPELFPGLIYRMIKPRIVLLIFVSGKVVLTGAKVRAEIYEAFENIYPILKGFRKTT-C • Domena poliglutaminowa reguluje zdolność C-końcowej domeny do wiązania DNA. • TBP jest kodowane przez gen polimorficzny – liczba Q (glutaminy) od 25-42. Gdy ilość większa (47 – 63)  ataksja móżdżkowo-rdzeniowa 17 (ang. spinocerebellar ataxia 17; SCA17) • Inną dziedziczną chorobą wywołaną zwiększeniem liczby powtórzeń Gln (czyli trójek CAG jest choroba Huntingtona, mutacja w genie huntingtiny).

  13. TBP oddziałuje z kasetą TATA a inne podjednostki kompleksu TFIID (TAF1 i TAF2) oddziałują z sekwencją inicjatora TAF = TBP-associated factor Przyłączają się kolejne podjednostki kompleksu inicjatorowego transkrypcji: TFIIA, TFIIB, polimeraza TFIIF, TFIIE, TFIIH i CAK (kinaza).

  14. Po kolei: Do TFIID przyłącza się TFIIA • TFIIA - heterotrimer (podjednostki: 35; 19 i 12,5 kDa). • Oddziałuje z TBP i stabilizuje tworzący się kompleks.

  15. Następnie przyłącza się TFIIB Pojedynczy łańcuch polipeptydowy (35 kDa). Łączy się z kompleksem TFIID•TFIIA tworząc kompleks potrójny: TFIID•TFIIA•TFIIB (kompleks DAB) TFIIB – oddziałuje ze specyficznymi sekwencjami DNA – BRE (TFIIBrecognition elements) obecnymi w niektórych promotorach (sekwencje otaczające sekwencję TATA)

  16. Następniedo kompleksu DAB przyłącza się polimeraza RNA II oraz TFIIF (kompleks) • Heterodimer - podjednostki: 74 i 30 kDa. Ma aktywność kinazy białkowej – ulega autofosforylacji. • Funkcja - istotny dla: • wyboru miejsca startu transkrypcji, • właściwej orientacji DNA względem kompleksu białek w obrębie promotora, • uwalniania polimerazy z promotora.

  17. Następuje przyłączenie czynnika TFIIE Tetramer: 2 łańcuchy a - 50 kDa i 2 łańcuchy b -33 kDa Rekrutuje TFIIH oraz stymuluje aktywność kinazy fosforylującej polimerazę RNA II.

  18. Przyłącza się kompleks TFIIH + CAK • TFIIH: 6 podjednostek • 62; 44; 34; 52; 89; 80 kDa • TFIIH tworzy kompleks z • CAK (kinaza aktywująca kinazy • zależne od cykliny; ang. CDK • activating kinase). • CAK = CDK7 + cyklina H + MAT1 • CDK7 – podjednostka CAK • odpowiedzialna za fosforylację • polimerazy RNA II Uwaga: TFIIH uczestniczy także w procesach NER

  19. Kompleks TFIIH i CAK pełni 3 funkcje: • Wiąże się do matrycowego DNA (wskazuje, która nić DNA ma być przepisana • Jest helikazą, rozplata fragment DNA. • Fosforyluje C-końcową domenę polimerazy – co oznacza koniec inicjacji, początek elongacji. • Aktywność TFIIH silnie zależy od jego interakcji z TFIIE.

  20. Kompleks polimerazy RNA II i podstawowych czynników transkrypcyjnych Numery oznaczają kolejność przyłączania się do kompleksu Lokalizacja poszczególnych białek nie jest zachowana na rysunku

  21. 1593 N-......YSPTSPAYEPRSPGGYTPQSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPN YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPS YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPS YSPTSPSYSPTSPNYSPTSPNYTPTSPSYSPTSPSYSPTSPNYTPTSPN YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPSSPRYTPQSPTYTPSSPSYSPSSPS YSPTSPKYTPTSPSYSPSSPEYTPTSPKYSPTSPKYSPTSPKYSPTSPT YSPTTPKYSPTSPTYSPTSPVYTPTSPKYSPTSPTYSPTSPKYSPTSPT YSPTSPKGSTYSPTSPGYSPTSPTYSLTSPAISPDDSDEEN - C 21 sekwencji – 100% zgodność z sekwencją konsensusową YSPTSPS (kolor czerwony i niebieski) 31 sekwencji – niepełna zgodność (kolor zielony) Budowa domeny C-końcowej (CTD) największej podjednostki polimerazy RNA II

  22. Fosforylacja reszt seryny w sekwencjach YSPTSPS w obrębie CTD polimerazy RNA II umożliwia odłączenie kompleksu polimerazy od promotora i zapoczątkowanie elongacji RNA Domena CTD jest także zaangażowana w procesy obróbki RNA – dołączanie czapeczki, dołączanie ogona poli-A, składanie RNA. Aktywność CTD w tych procesach jest regulowana wzorem fosforylacji. CTD stanowi platformę dla białek uczestniczących w tych procesach.

  23. 5’-UTR(ang. untranslated region)– kilkadziesiąt – kilkaset nukleotydów Sekwencja kodująca(przeciętnie) - 1000 – 2000 nukleotydów (max. 114 000, tityna) 3’-UTR– kilkadziesiąt – 2000 nukleotydów poli A– 30 – 250 nukleotydów

  24. Budowa czapeczki 5’ trifosfataza polinukleotydowa + transferaza guanylilowa (CE) metylotransferaza guaninowa metylotransferaza 2O’-rybozy 5’ – 5’

  25. Przyłączanie czapeczki Czapeczka przyłączana jest do RNA zaraz po rozpoczęciu transkrypcji (< niż 30 n). Enzym przyłączający czapeczkę (CE, capping enzyme) oraz metylotransferaza guaninowa (MT) oddziałują z ufosforylowaną domeną CTD polimerazy RNA II.

  26. Zakończenie transkrypcji Sekwencja bogata w U (USE) może, ale nie musi występować

  27. CPSF – ang. cleavage and polyadenylation specificity factor CSTF – ang. cleavage stimulation factor, trimer

  28. Istnienie intronów można zaobserwować Nagroda Nobla za odkrycie intronów (1993) Richard J. Roberts Phillip A. Sharp (1977)

  29. Inne potwierdzenie: Doświadczenie „pulse-chase” badające wbudowywanie znakowanego trifosforanu urydyny do RNA  początkowo radioaktywność znajduje się w znacznie większych cząsteczkach RNA niż dojrzały RNA. Jeszcze inne potwierdzenie: Porównanie sekwencji DNA i cDNA (sekwencjonowanie). W wyniku transkrypcji powstaje hnRNA (ang.heterogeneousnuclear RNA)

  30. Składanie mRNA Gen globiny - 1525 pz: 622 w egzonach, 893 w intronach Gen owoalbuminy - 7500 pz: 8 krótkich egzonów (1858 pz) Gen owotransferyny – 10 000 pz: 10 krótkich egzonów (2200 pz) http://courses.agri.huji.ac.il/71065/14/images/b-02-intron-exon-mosaic.jpg

  31. Skrajności: Geny ssaków kodujące histony i interferony klasy I nie mają intronów Gen titiny (konektyny) ma 362 introny Tityna to największe znane białko (jeden łańcuch polipeptydowy) – blisko 27 000 aminokwasów (przeciętne białko ma 500 aa).

  32. W trakcie transkrypcji syntetyzowany RNA jest włączany w kompleksy białkowe  tworzą się splajsosomy. W splajsosomach dochodzi do wycinania intronów i składania mRNA. W skład splajsosomów wchodzą różne snRNP („snurps”; ang. small nuclear ribonucleoproteins). Każdy snRNP to kompleks kilku lub kilkunastu łańcuchów polipeptydowych i krótkiego RNA (snRNA, przeciętnie 100 - 200 n). snRNA oraz snRNP, w skład których wchodzą dane snRNA oznacza się U1, U2, U3 itd.

  33. snRNP zawierają takie podjednostki białkowe, które są wspólne dla kilku różnych snRNP i takie które są specyficzne tylko dla danego snRNP. Np. Dla U1, U2, U4/U6, i U5 są wspólne następujące polipeptydy SNRP (Sm) : B, D1, D2, D3, E, F i G. Tworzą one rdzeń (pierścień) do którego dołączają się inne, specyficzne łańcuchy (np. dla U1 to białka U1-A; U1-70K, U1-C). snRNP rozpoznają połączenia intron-egzon (egzon-intron) i prowadzą reakcje składania mRNA

  34. U1-A U1-70K kompleks białek Sm U1-C U1-snRNA Stark H et al. Nature. 2001 409, 539-42

  35. Miejsca wycinania intronów są precyzyjnie określone przez sekwencje nukleotydów na granicach: egzon-intron oraz intron-egzon. Długość intronu: 50 – 10 000 nukleotydów Najkrótszy - 25 nukleotydów* Najdłuższy – 55 000 nukleotydów* takie wartości udało mi się znaleźć w literaturze

  36. miejsce splajsingowe 5’ miejsce rozgałęzienia miejsce splajsingowe 3’ Wielkość liter odpowiada prawdopodobieństwu występowania określonego nukleotydu w określonej pozycji. http://www.mskcc.org/mskcc/_assets/content-image/56182.gif

  37. Wycinanie intronów i składanie mRNA zachodzi w wyniku dwóch reakcji transestryfikacji W przypadku składania mRNA transestryfikacja zachodzi nie między dwoma różnymi cząsteczkami a pomiędzy fragmentami tej samej cząsteczki.

  38. związek pośredni w kształcie lassa

  39. Oddziaływanie snRNA z miejscami na granicy intron-egzon Sm – konserwatywne miejsce przyłączania białek Sm do snRNA www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema14.htm

  40. U2 i U6 tworzą wspólnie centrum katalityczne splajsosomu. Ich snRNA zawierają odcinki częściowo komplementarne.

  41. U4 snRNA i U2 snRNA są częściowo komplementarne z U6 snRNA w U4/U6 snRNP U2/U6 w splajsosomie http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2199-6-20-5.gif

  42. Istnieją introny, które mogą same się wycinać: Grupa I: -w genomie mitochondrialnym niektórych grzybów -w genomie chloroplastów -w genomie jądrowym niższych eukariontów (np. orzęski) Grupa II: -w genomie mitochondrialnym drożdży i niektórych innych grzybów – np. introny w mRNA kodującym cytochrom b i podjednostki oksydazy cytochromowej -w genomie chloroplastów rRNA mRNA W autosplajsingu biorą udział białka - maturazy

  43. Nagroda Nobla z Chemii 1989"for their discovery of catalytic properties ofRNA" Sidney AltmanThomas R. Cech (odkrycia z 1981/82)

  44. Składanie autokatalityczne przez introny grupy I Kluczowa rola guanozyny lub nukleotydów guanozynowych (GMP, GDP, GTP)

More Related