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大肠杆菌感受态细胞的制备. 1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒 DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。. 2. 相关知识及原理 感受态细胞 (Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如： CaCl ， RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA 的载体分子通过的感受态细胞 (competent cell) 。. 3 ．仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；
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1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
3．仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等； 菌株：E.coli DH5α 质粒：重组质粒以及pUC19空质粒； LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100µg／mL，X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000储备液，用时按培养基的量再加入）； 预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）
4．操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； （4）0～4℃，4000r／min离心10min； （5）弃去上清液，加入500µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；
（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
