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河北昌黎酿酒葡萄乳酸菌菌种构成研究

河北昌黎酿酒葡萄乳酸菌菌种构成研究. 指导教师：高大威 汇报人：刘凯. 项目研究背景. 乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸细菌的通称。 乳酸菌在葡萄酒酿造中，通过苹果酸 - 乳酸发酵 (MLF) 将 L- 苹果酸转化为 L- 乳酸和 CO2 ，起到降低酸度、增强细菌的稳定性和改善酒风味的重要作用。 寒冷地区葡萄中酸度高，通过 MLF 的生物降酸途径是一个较好选择。目前， MLF 已成为酿造优质红葡萄酒和部分白葡萄酒的一个重要环节。启动 MLF 主要有自然触发和人工添加 MLF 发酵剂两种方式。

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河北昌黎酿酒葡萄乳酸菌菌种构成研究

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Presentation Transcript

  1. 河北昌黎酿酒葡萄乳酸菌菌种构成研究 指导教师：高大威 汇报人：刘凯

  2. 项目研究背景 • 乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸细菌的通称。 • 乳酸菌在葡萄酒酿造中，通过苹果酸-乳酸发酵 (MLF) 将L-苹果酸转化为 L-乳酸和 CO2，起到降低酸度、增强细菌的稳定性和改善酒风味的重要作用。 • 寒冷地区葡萄中酸度高，通过 MLF 的生物降酸途径是一个较好选择。目前，MLF 已成为酿造优质红葡萄酒和部分白葡萄酒的一个重要环节。启动 MLF 主要有自然触发和人工添加MLF 发酵剂两种方式。 • 自然触发主要依靠葡萄种植区和葡萄酒厂中天然存在的乳酸菌启动 MLF，此种方式有利于酿出具地区特色风味的葡萄酒，但存在难于控制和酒的质量无法保证的危险现代化的酿酒厂已不再采用这种方法。 • 人工添加 MLF 发酵剂是通过添加商业菌株来控制 MLF 过程。但由于发酵剂不适应特定地区葡萄酒，亦存在生长缓慢甚至不生长的问题。 • 解决这一问题要从本地区筛选土著优良苹果酸-乳酸细菌 作为 MLF 发酵剂 。

  3. 项目研究创新点与特色 • 对以酿酒葡萄为分离源直接分离乳酸菌进行了有益的尝试。 • 对我国昌黎葡萄酒产区优良苹果酸-乳酸细菌进行了研究。 • 采用16SrRNA 序列分析的方法鉴定酒类酒球菌。 • 从葡萄酒酒样中分离到布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，这是国内首次报道从酒样中分离到布氏乳杆菌。

  4. 项目研究实践应用情况 • 对分离菌株的酿酒适应性（对低pH、高酒精含量）进行了系统研究，结果表明，不同菌株间的酿酒适应性存在着很大的差异。其中，酒类酒球菌C10 和 J2能耐受 pH 3.0、酒精度 14 % 的生长环境，因其能在强酸和高酒精度的葡萄酒环境中生长，具较好的酿酒适应性，具有做 MLF 发酵剂的潜力。 • 在后期的生产性能检测中，菌株MLF 发酵性能良好。将酒类酒球菌C10 和 J2，以接量6×105cfu/ml加入模拟葡萄酒中，控制温度在18～20℃。每隔1d进行1次高效液相色谱检测，测定苹果酸和乳酸含量，以未接种的酒样为对照。结果显示，接种后的酒样启动了MLF，随着发酵的进行苹果酸的含量下降，乳酸的含量增加，15d左右结束发酵。取发酵后的酒样测定其色度和色调，结果显示，部分酒样中色度高于对照，这有助于解决一般经MLF发酵后葡萄酒变浅的问题。 • 就目前的研究结果来看，酒类酒球菌C10 和 J2确实能启动MLF发酵，降低葡萄酒的酸度，且发酵时间与商业发酵剂相当，甚至能弥补一般发酵剂会导致葡萄酒色度降低的不足，这充分说明其在生产应用中具有巨大潜力。

  5. 三段划线分离菌落 斜面转接纯化 项目成果展示—分离纯化 菌株的培养 转接后的斜面

  6. 项目成果展示—分离纯化 酵母菌菌落形态 酵母菌菌体形态 酵母菌菌体形态 酵母菌菌体形态

  7. 项目成果展示—分离纯化 乳酸菌菌落形态 乳酸菌菌体形态 乳酸菌菌体形态 乳酸菌菌体形态

  8. 项目成果展示—乳酸层析 层析过程 层析过程 层析结果 层析结果

  9. 项目成果展示—生理生化鉴定 硫化氢试验 吲哚试验 明胶液化试验 糖发酵试验

  10. 项目成果展示—RAPD分析 RAPD电泳图谱

  11. 项目成果展示—RAPD分析 30株乳酸菌的系统进化树

  12. 项目成果展示—耐性筛选 25株乳酸菌在不同的pH条件下生长的情况 25株乳酸菌在不同的酒精度条件下生长的情况

  13. 项目成果展示—16SrDNA测序 16SrDNAPCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图

  14. 项目成果展示—16SrDNA测序 菌株部分16SrDNA片段序列的峰谱图，自上之下依次为菌株C10、J2、J3、J5、MJ12和MJ17。

  15. 项目成果展示—16SrDNA测序 • GATCAACATTCGGATTTTACCTTAGGCACCGGCCTCTAAAAGTTAGCCAAGCGACTTTGGGTACTTCCGACTCCCATGATTTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGACATGCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGCCTTCGTGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAGTCCGAACTGAGAGAAGTTTTAAGAGATTAGCTTACCGTCGCCGGTTTGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTTGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTATCCAATGTTCCGAAGAAAAGCTTTCATTACAAAAGCGATCATTGGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTTTTCGCGTATCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTAAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCTCAGGCGGGGTGCTTAATGCGTTTGCTACGTCACTAGGAGGCGGAAACCTCTTAACAACTAGCACCCATCGTTTACGGTATGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAACGTCAGTTACGATCTAGCAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCACATTATCTA

  16. 项目成果展示—16SrDNA测序 • GATTCGATCTCGGATTTTACCCTTTAGGCACCGGCCTCTAAAAGTTAGCCAAGCGACTTTGGGTACTTCCGACTCCCATGATTTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGACATGCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGCCTTCGTGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAGTCCGAACTGAGAGAAGTTTTAAGAGATTAGCTTACCGTCGCCGGTTTGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTTGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTATCCAATGTTCCGAAGAAAAGCTTTCATTACAAAAGCGATCATTGGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTTTTCGCGTATCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTAAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCTCAGGCGGGGTGCTTAATGCGTTTGCTACGTCACTAGGAGGCGGAAACCTCTTAACAACTAGCACCCATCGTTTACGGTATGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCCTCAACGTCAGTTACGATCTAGCAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCTTCCACATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTTGCCTCTATCGCACTCAAGTAAATCAGTTTCCAATGCAGTTCCGAGGTTTGGGCCTCGGGATTTCACATCAGACTTAATAAACCGTCTGCGCTCGCTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGGACATACGTATTACCGCGGCCTGCTGGCACGGTATTTAGCCATCCCTTTTCTTGGTAAGGAACGTCCAAGCTGAAAACTTTCTCTGGAAATCA

  17. 项目成果展示—16SrDNA测序 • GCTCAGAAAACTCTACGGCTACCTTGTTACGACTGAGCCGTGATCCCACCCTACTTTGGGCGTGCAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGTTTTCAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCGTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGTCCCCGAAGGGAACACCTGATCTCTCAGGTTAGCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAATCTTGCGATGGTG

  18. 项目成果展示—16SrDNA测序 基于16SrDNA序列分析以Neighbor Joining法（Max Seq Difference=0.1）构建的菌株C10、J2的系统发育树

  19. Thank you！ 汇报人：刘凯汇报日期：2011-6-16

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