Seminario 6

1. Seminario 6 2006 – Human Mediator enhances basal transcription by facilitating recruitment of TFIIB during PIC assembly (Baek, Kang, Roeder) Mediador mejora la transcripción basal por la facilitación del reclutamiento de TFIIB en el ensamblaje del PIC

2. Transcripción • ARN polimerasa II • Factores de Transcripción Generales (GTFs): TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH Necesarios y suficientes para transcripción basal de templados de DNA con TATA y para la formación del PIC

3. Ensamblaje del PIC Estructura del complejo TBP-TATA

4. Modelo de Holoenzima Ensamble secuencial Formación del PIC: Dos modelos

5. CDK HEAD MIDDLE TAIL Mediador Es un coregulador general de la transcripción Compuesto por distintas subunidades y dominios Conservado en todos los eucariotas Forma complejos con RNA pol II

6. Mediador • Aumenta nivel de transcripción basal (cooperatividad con TFIID en ensamblaje y estabilización del PIC y en la reiniciación de transcripción en levaduras) • Estimula actividad kinasa de TFIIH en el CTD de Pol II necesario para la transcripción basal y la formación del PIC dependiente de activador Interacciones con la pol II y los GTFs facilitan la formación y función del PIC

7. Mediador interaccionando con la maquinaria basal de la transcripción La cola de CTD no fosforilada está asociada al mediador y a componentes de la maquinaria de iniciación La fosforilación parcial de la cola de CTD hace que tanto el mediador como los GTFs se separen

8. Mediador • No esencial para transcripción basal in vitro con RNA pol II y GTFs purificados • Necesario para transcripción basal en extractos nucleares y para transcripción activada  ¿es coactivador, contrarresta la presencia de algún inhibidor o las condiciones in vivo son más restricivas? • Compensa la presencia de GTFs en niveles limitantes, o de inhibidores

9. Paper • Estudio de la interacción Med – TFIIB Hipótesis: • Mediador recluta y estabiliza PIC • facilita fosforilación de CTD Preguntas: • ¿El ensamblaje del PIC en extractos nucleares es igual que con TFs purificados? • ¿TFIIB tiene un efecto de reclutamiento similar al del Mediador?

10. Materiales • Extracto nuclear HeLa inmunodepletado de GTFs y Mediador (tratamiento con anticuerpos, crosslinking, agregado de anti-anticuerpos y precipitación) • GTFs y Mediador con tags de His o epítopes, expresados en bacterias y purificados • Templados de ADN biotinilado con o sin TATA + bolitas de Streptavidina-Sefarosa

11. Materiales • SDS PAGE de dos preparaciones de Mediador Purificado FLAG-tags  epítopes

12. Métodos Templados inmovilizados ↓ Preincubación con extracto nuclear y GTFs ↓ Lavado Incubación con Mg2+, NTPs ↓ Electroforesis Phosphorimager ↓ nivel de transcripción corte EcoRI Western Blot (Immunoblot) ↓ Unión de GTFs o Mediador

13. UNIÓN MED DEPENDIENTE Unión no específica TFIIH y TFIIF UNIÓN TATA DEPENDIENTE Resultados • Templados + NE(IID/ Med) + TBP (TATA Binding Protein) + Med (variable) Mediador  papel importante en reclutamiento de, al menos, TFIIB TFIIE y Pol II

14. Aumento >9x (TATA+ vs TATA-) Aumento >5x (TATA+Med+ vs TATA+Med-) = Aumento 49x con TATA y Med Correlación entre reclutamiento Med-dependiente de GTFs y Pol II y nivel de la transcripción basal Resultados

15. CORRELACIÓN TEMPORAL Resultados • Comparación temporal (preincubación por tiempos variables, templado con TATA + NE(Med) + Med) Anticuerpos Nivel de transcripción a distintos tiempos Reclutamiento de Med y GTFs a distintos tiempos El reclutamiento del PIC depende de Mediador y determina el nivel basal de transcripción

16. Gal4  aumenta reclutamiento de Med y GTFs; si no hay Med, el reclutamiento de GTFs es mucho menor Esto se correlaciona con los niveles de transcripción Esto se correlaciona con los niveles de transcripción Resultados • Templados iG5HML con sitios para activador Gal4 + NE(Med) + Med + Gal4 Anticuerpos Med parece ser esencial para el aumento de la transcripción en presencia de un activador (los niveles de reclutamiento no parecen diferir por Gal4)

17. Un exceso de TFIIB (25x TFIIB endógeno) compensa la falta de Med con respecto a un extracto nuclear no depletado, en cuanto a niveles de transcripción basal Un exceso de Med no compensa la falta de TFIIB Un exceso de TFIIF no compensa la falta de Med Med  el aumento de transcripción se daría por aumento de reclutamiento de TFIIB Control recíproco Control especificidad Resultados • Templados con TATA + NE(Med) + TFIIB en exceso

18. La transcripción disminuye y sólo vuelve a niveles basales si se suplementa con TFIIB purificado Control de la depleción  sólo se eliminó TFIIB y muy pequeñas cantidades de Med u otros GTFs Resultados • Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB ¿Se debe a disminución del reclutamiento del PIC cuando se elimina TFIIB?

19. Disminuye reclutamiento de Pol II y de TFIIE en ausencia de TFIIB TFIIB no es requerido para el reclutamiento de Med, pero sí de Pol II y TFIIE Resultados • Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB

20. Resultados • Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB El mismo fenómeno se aprecia a nivel transcripcional; aunque se haya reclutado Med, sin TFIIB hay muy poca transcripción porque no se recluta eficientemente parte del PIC

21. El nivel de transcripción se ve limitado por el tiempo de reclutamiento del Med cuando es agregado en la incubación Resultados

22. El reclutamiento de Med también depende de TFIID, pero no de TBP sola  importancia de TAFs Resultados • Templados con TATA + Med + TFIID/TBP

23. Conclusiones • Mediator aumenta la transcripción basal por reclutamiento de TFIIB, TFIIE y Pol II (como mínimo), como se infiere por la correlación temporal de transcripción Mediator-dependiente y reclutamiento Mediator-dependiente • El reclutamiento de Mediator es un paso limitante en la formación del PIC y parece depender de la interacción con TFIID (habiendo ésta reconocido a la TATA previamente)

24. Conclusiones • Mediator aumenta la síntesis indirectamente al reclutar a TFIIB, que a su vez recluta a Pol II. • Es necesario para transcripción basal en extractos nucleares pero no con factores purificados; sin embargo aún no se encontraron cofactores negativos que pudieran explicarlo. Puede deberse a una limitación en los GTFs en los extractos naturales, lo cual concuerda con que TFIIB en exceso puede compensar su ausencia en cuanto a niveles de transcripción basal y reclutamiento de Pol II. También un exceso de TFIIH puede producir este efecto (Nair et al., 2005).

25. Conclusiones • Este reclutamiento Med-independiente permite descartar el modelo de holoenzima en que Med cataliza la formación del complejo de Pol y los GTFs que deben unirse juntos a TFIID • También implica que aunque los GTFs son irreemplazables por exceso de Mediator, éste podría compensar niveles limitantes de los mismos in vivo, actuando de forma cooperativa. En ausencia de Mediator se necesitaría un nivel muy alto de GTFs.

26. Conclusiones • Mediator actúa además de forma directa estimulando la actividad kinasa de TFIIH para la fosforilación de CTD, lo que permite una transcripción eficiente por aumento del reclutamiento y estabilización de factores. • La transcripción activada, tanto en extractos nucleares como con factores purificados, es siempre Med-dependiente.

27. Conclusiones • Mediator formaría un complejo estable con TFIID, luego de lo cual se reclutaría el resto de los GTFs y la Pol II (no niega que se pudiesen unir en distinto orden, aunque de forma menos eficiente al desaparecer el efecto cooperativo)  stepwise model • Este hecho, sumado al factor correspondiente a la interacción entre Mediator y los GTFs, proveería instancias extra para el control de los niveles de transcripción  plasticidad regulatoria

28. Críticas • El experimento intenta acercarse a condiciones fisiológicas en cuanto al extracto utilizado; sin embargo el ADN no se encuentra cromatinizado, factor que tiene efectos sobre los niveles de transcripción in vivo. • Concluyen que el reclutamiento de Mediator es el paso limitante, pero éste es dependiente de unión de TFIID  la unión de TBP o TAFs podría ser el verdadero paso limitante • No analiza función de Mediator en el PIC post-reclutamiento, que pueden haber afectado los niveles de transcripción observados