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免疫组织化学技术 (IHH)

免疫组织化学技术 (IHH). 免疫组织化学技术 (IHH). 免疫细胞化学技术（ ICC ）. 是免疫学和组织化学相结合的一个分支学科. 以免疫学的抗原抗体反应为理论基础. 利用抗原抗体间的特异性免疫反应 , 并通过组织化学的手段 准确具体地确定抗原的组织或细胞学分布极其数量. 蛋白水平组织学原位研究的首选技术. 7-10 天左右. 结果的分析. 免疫组化的操作. 组织标本的处理. 实验过程. 免疫组化的准备. 组织切片的制作. 免疫组化的准备. 仪器设备. 免疫试剂. 抗体. 缓冲液. 冰箱. 抗体. 微波炉. 储存. PBS.

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Presentation Transcript

  1. 免疫组织化学技术(IHH)

  2. 免疫组织化学技术(IHH) 免疫细胞化学技术（ICC） 是免疫学和组织化学相结合的一个分支学科 以免疫学的抗原抗体反应为理论基础 利用抗原抗体间的特异性免疫反应,并通过组织化学的手段 准确具体地确定抗原的组织或细胞学分布极其数量 蛋白水平组织学原位研究的首选技术

  3. 7-10天左右 结果的分析 免疫组化的操作 组织标本的处理 实验过程 免疫组化的准备 组织切片的制作

  4. 免疫组化的准备 仪器设备 免疫试剂 抗体 缓冲液 冰箱 抗体 微波炉 储存 PBS 定时钟 来源 效价 分装 TBS 移液器 孵育盒 最佳稀释 度的测定 免疫组化试剂 切片架 冲洗瓶

  5. 选择最佳抗体稀释度的方法 一抗稀释度 特异染色强度 非特异背景染色强度 1:50 ++++ ++ 1:100 +++ ++ 1:200 + +++ 1:400 + ++ 1:500 - + - 阴性对照 -

  6. 免疫组化的操作 PAP法 SPA法 ABC法 SP法 LAB法 BRAB法

  7. 基本原理与步骤 洗去未结合上的标记抗体 标记抗体与标本中的抗原发生免疫反应 标记物显色反应 观察

  8. 亲和素-过氧化物酶复合物 HRP e 生物素二抗 + DAB H2O2 氧化聚合 一抗 苯乙肼多聚合体 不溶性棕色沉淀 抗原 2 呈色反应 1 抗原抗体反应

  9. SP法操作流程 （1）脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟；

  10. 2） PBS洗2~3次各5分钟； 3）抗原修复； 4）PBS洗2~3次各5分钟； 5） 3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟 6）PBS洗2~3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加生物素化Ⅱ抗40~50μl,室温静置，或37℃1小时； 12）滴加抗生物素-过氧化物酶溶液； 13）PBS洗3次各5分钟； 14）DAB显色5~10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 15）PBS或自来水冲洗10分钟； 16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 17）自来水冲洗10~15分钟； 18）脱水、透明、封片、镜检。

  11. 关键点: 1 内源性酶的消除和血清封闭 0.3%H2O2消除内源性过氧化物酶 抗体成分吸附于高电荷的胶原和结缔组织上,正常 血清或脱脂奶粉封闭.

  12. 2 抗原修复: 福尔马林固定,石蜡包埋导致 蛋白交联,封闭了组织中的抗原, 遮蔽部分抗原决定簇 降低了免疫反应活性 提高敏感性与特异性 蛋白酶消化法:如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶 热诱导抗原修复: 利用高温,高压对常规固定的石蜡切片进行处理的过程

  13. 抗原修复缓冲液： 有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、 Tris （pH7-8）、EDTA（pH8.0~9.0）等， 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的优点是染色背景清晰，适 合于大多数抗体， Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。 柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，

  14. 抗原热修复注意事项： 1 热处理后要自然冷却 2 热处理时缓冲液要充足，避免切片蒸干 3加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复

  15. 微波抗原修复： 将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有已煮沸缓冲液（4.2 ml柠檬酸盐缓冲液+450 ml H20）的烧杯中，高火档15分钟，解冻档8分钟（针对膜表达单抗）或中火档4分钟，解冻档8分钟（针对浆表达单抗）。将烧杯取出，浸入冷水中（不可将玻片从缓冲液中取出冷却），自然冷却；

  16. 结果的分析 一 染色结果的观察 1、阳性结果应定位在细胞相应的部位， 在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。 不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。 判定方法： 结构清晰，着色明显高于背景，在相应部位出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，不着色或显色强度与背景无差别者为阴性细胞。

  17. 2 组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达。 3、染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。

  18. 4、组织切片背景深与下列因素有关： （1）石蜡切片脱蜡不干净； （2）第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高； （3）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多； （4）抗体不纯； （5）抗体孵育后切片清洗不干净。

  19. 5、免疫组化实验对照 为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。

  20. 1、阳性对照： 选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。 2、阴性对照： 选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性。 3 空白对照：

  21. 二 染色结果的记录与分析 定性 ：阳性或阴性（染色强度：强、弱、无） 定量： 整张切片中着色癌细胞的百分数>75%、75-5%、<25%分别判为阳性、弱阳性和阴性；

  22. 每例切片随机选择5个高倍视野（×400） 统计阳性细胞数量和着色程度，取其平均值，评分标准：采用免疫组化评分（HIS值）法进行统计： A为阳性细胞数目: 分级0%=0、1～10%=1、11～50%=2、51～80%=3、81～100%=4 B为阳性细胞显色强度: 分级0（无显色，阴性）、1（浅黄色，弱阳性）、2（棕黄色，阳性）、3（棕褐色，强阳性） 以A与B之乘积作为IHS值，用于免疫组化评分

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