カシス・ポリサッカライド（ＣＡＰＳ）の発見から商品化まで

1. カシス・ポリサッカライド（ＣＡＰＳ）の発見から商品化までカシス・ポリサッカライド（ＣＡＰＳ）の発見から商品化まで 2007 年 2 月 16 日メルシャン（株） 商品開発研究所高田　良二

2. ステップ １ カシス・ポリサッカライド（ＣＡＰＳ）の発見

3. ｶｼｽ由来多糖画分のﾏｳｽにおける抗腫瘍効果ｶｼｽ由来多糖画分のﾏｳｽにおける抗腫瘍効果 【目的】現代日本社会においては、不規則な生活習慣、食事の偏り、精神的ストレスなど免疫系にダメージを与える要因が氾濫している。本研究の最終目的は、身近で安心感のある果実を素材とした免疫調節食品を消費者に提供することである。【研究経緯】すでに我々は、ﾏｳｽ・腹腔ﾏｸﾛﾌｧｰｼﾞの系において、ｶｼｽ果汁に強いｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性が存在し、その活性はﾎﾟﾘﾌｪﾉｰﾙを除去した多糖画分に存在することを報告した（2002 年 日本農芸化学会大会）。　　　　　　　　　今回は、ｶｼｽ由来多糖画分のﾏｳｽにおける抗腫瘍効果について報告する。【ｶｼｽとは】 　仏名 ｶｼｽ，英名 ﾌﾞﾗｯｸ･ｶﾗﾝﾄ，和名 黒房ｽｸﾞﾘ。北ｱｼﾞｱやﾖｰﾛｯﾊﾟが原産とされ、ﾕｷﾉｼﾀ科ｽｸﾞﾘ属に属する落葉低木から取れる黒紫色の実。ﾎﾟﾘﾌｪﾉｰﾙ化合物やﾋﾞﾀﾐﾝ C が豊富であることで有名。 日本農芸化学会大会発表スライド（2006 年 3 月） [一部改変]

4. 図 137 種類の果汁添加が Mφ の IL-1β 産生に及ぼす影響 6000 ｶｼｽ 4000 IL-1produced (pg/ml) 2000 0 2000 3000 0 1000 4000 Total phenol content (ppm) ｶｼｽ果汁はﾏｸﾛﾌｧｰｼからのｻｲﾄｶｲﾝ産生を強く誘導する（in vitro） 科，属の異なる 37 種類の果実を破砕　　　↓果汁の pH を中性に調整　　　↓遠心（9,000 × g, 10 min）上清回収 ICR ﾏｳｽにﾁｵｸﾞﾘｺﾚｰﾄ培地を腹腔内注射　　　↓4 日後に腹腔ﾏｸﾛﾌｧｰｼﾞ採取　　　↓96 ｳｪﾙ･ﾌﾟﾚｰﾄに分注（1 × 106 cells/ml） 添加果汁終濃度： 2.5% (v/v) （16～20 h 培養） ELISA 試験 （TNF-α，IL-1β，IL-12p70） ｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性とﾎﾟﾘﾌｪﾉｰﾙ含有量との間に相関関係は見られなかった。

5. 図 2　ﾍﾐｾﾙﾗｰｾﾞ（Aspergillus niger）で完全消化した　　　　ｶｼｽ多糖画分のｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性の変化 120 100 80 ＊＊：p<0.01， Mean ± S.E. TNF--inducing activity (%) 60 40 20 ** 0 Beforedigestion Afterdigestion ｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性は多糖画分に由来する 【ｶｼｽ多糖画分の調製法】 ｶｼｽ果汁遠心（9,000 × g，10 min）上清回収　　　↓陽，陰ｲｵﾝ交換樹脂ｶﾗﾑに通液（吸着 [ｲｵﾝ性化合物] 画分に活性無し）　　　↓非吸着画分を SEP-PAK C-18 ｶﾗﾑに通液（吸着 [ﾎﾟﾘﾌｪﾉｰﾙ] 画分に活性無し）　　　↓非吸着画分を純水にて透析　　　↓凍結乾燥（ｶｼｽ多糖画分，収量： 9 g 乾燥物/ L 果汁） 活性の本体は（中性）多糖画分に存在することが改めて示された。 本ｶｼｽ多糖画分をcassis polysaccharide（CAPS）と命名した。

6. 伝承薬としてのカシスの効果について • カシスはおもに新鮮なジュースや葉から作られるお茶などの形で、古代からあらゆる病気の万能薬として使用されてきた。 • ：16世紀には民間薬としての使用が記録 • ：18世紀にはフランスのモランタン神父は「カシス の搾り汁は万病に効く秘薬であり、若返りにも効果がある」と報告＊ • 　　　＊Les Proprietes Admirables du Cassis (1712), カシスの驚異 • 古くよりヨーロッパではのどの傷み、発熱、胃痛、生理不順、下痢、腎炎、膀胱炎、倦怠感、リューマチ、関節炎、水腫症、歯肉炎など多くの病気に対する治療に使われてきた実績がある。また、その副作用も報告されておらず、安全な食品とされている。 【酒類業界におけるカシス】 フランスの伝統リキュールであるカシス・リキュールの主原料として有名。本格リキュールのジャンルで消費量が最も多いのもカシスである。 黒紫色（希釈すると赤紫色）で強い酸味と独特の芳香を有す。また、赤ワインを表現する際に一つの例えとして良く使用される。

7. ｶｼｽ･ｽﾄﾚｰﾄ果汁（経口投与，10 ml/kg）CAPS 溶液（経口投与，10 ml/kg） day –7 ～ 14，daily day 1 ～ 9, daily Adriamycin（腹腔内投与，0.5 mg/kg） day 2 ～ 10，every other day OK-432（腹腔内投与，1 KE/mouse） day 0↑Ehrlich 結節腫瘍を鼠径部皮下へ移植 day -14 day -7 day 7 day 14 ↑腫瘍摘出，重量測定 予備飼育期間（♀，5 週齢にて購入） CAPS 溶液の多糖濃度は 4 mg/ml [ﾌｪﾉｰﾙ硫酸法測定値] とした。（in vitroﾏｳｽ･腹腔ﾏｸﾛﾌｧｰｼﾞの系においてｽﾄﾚｰﾄ果汁と同程度のｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性を示した濃度。） CAPS の ICR ﾏｳｽにおける抗腫瘍効果= 実験方法 =

8. 図 3CAPS の Ehrlich 結節腫瘍に対する増殖抑制効果 4 ＊＊：p<0.01，＊＊＊：p<0.001 vs PBSMean ± S.E. 3 ** Tumor weight (g) ** 2 *** *** 1 51% 抑制 45% 抑制 64% 抑制 62% 抑制 0 Crudejuice CAPS OK-432 Adriamycin PBS CAPS の ICR ﾏｳｽにおける抗腫瘍効果= 実験結果 = in vivo試験においても CAPS が本生理活性の本体であることが示唆された。（参考文献： Biosci. Biotechnol. Biochem., 69 (11), 2042-2050, 2005）

9. CAPS の ICR ﾏｳｽにおける抗腫瘍効果～ 果汁レベルでの投与量の検討 ● 投与ｻﾝﾌﾟﾙ： ｶｼｽ果汁（ｽﾄﾚｰﾄ[100%]，5 倍希釈[20%]，50 倍希釈[2%]） および PBS（ｺﾝﾄﾛｰﾙ） ● 投与ｽｹｼﾞｭｰﾙ： 経口投与（10 ml/kg）開始から 7 日後に腫瘍移植，さらに 14 日後に腫瘍摘出 写真　摘出した Ehrlich 結節腫瘍 含 0.09 mg CAPS/ml 平均 45%抑制 含 0.9 mg CAPS/ml 平均 55%抑制 含 4.4 mg CAPS/ml 平均 76%抑制 50 倍に希釈したｶｼｽ果汁を投与した場合でも有意に抗腫瘍効果を発揮した。

10. 腫瘍摘出と同時に脾臓を摘出 ⇒ 脾細胞を 96 ｳｪﾙ･ﾌﾟﾚｰﾄに分注 （2.5 × 106 cells/ml） ⇒ 96 h 培養後 ELISA 試験 図 4　脾細胞からの各種ｻｲﾄｶｲﾝ産生ﾊﾟﾀｰﾝ　 ＊：p<0.05， ＊＊：p<0.01，＊＊＊：p<0.001 vs PBS（tumor-bearing） （正常ﾏｳｽからも脾臓摘出） 40 200 【IL-4】 【IL-2】 ** ** 150 30 IL-4 (pg/ml) IL-2 (pg/ml) 100 20 * *** 50 10 0 0 CAPS(tumor-bearing) PBS(normal) PBS(tumor-bearing) PBS(normal) PBS(tumor-bearing) CAPS(tumor-bearing) 100 2000 *** *** 【IL-10】 【IFN- 】 75 1500 IL-10 (pg/ml) IFN-(pg/ml) 50 1000 25 500 ** *** 0 0 CAPS(tumor-bearing) CAPS(tumor-bearing) PBS(normal) PBS(tumor-bearing) PBS(tumor-bearing) PBS(normal) CAPS の ICR ﾏｳｽにおける抗腫瘍効果～ 脾細胞におけるｻｲﾄｶｲﾝ産生ﾊﾟﾀｰﾝの変動 Th1 ｻｲﾄｶｲﾝ： IL-2，IFN-γ ⇒ 担癌ﾏｳｽにおける CAPS 投与は PBS 投与と比較して有意に上昇。Th2 ｻｲﾄｶｲﾝ： IL-4 ⇒ PBS投与担癌ﾏｳｽと比較すると上昇はしたが、正常ﾏｳｽと比較すると顕著に低下。　　　　　　　　　IL-10 ⇒ 上昇（Mφ 等の過剰活性化抑制？）。　　　　Th1（IFN-γ） > Th2（IL-4）。

11. 図 5CAPS の Ehrlich 細胞増殖に対する直接的影響 120 100 * 80 Cell viability (%) *** 60 ＊：p<0.05， ＊＊＊：p<0.001vs PBS（polysaccharide free）Mean ± S.E. 40 *** 20 0 10 100 1000 1 Polysaccharide concentration (g/ml) CAPS の Ehrlich 培養細胞に対する直接的影響（in vitro） 【細胞生存率測定法】Ehrlich 腫瘍細胞を 96 ｳｪﾙ･ﾌﾟﾚｰﾄに分注 （1 × 105 cells/ml）　　　↓CAPS 希釈系列（終濃度 1 ～ 0 mg/ml）を添加　　　　↓72 h 培養後 WST-1 法にて細胞生存率を測定 CAPS は終濃度 250 μg/ml 以上の高濃度になるまで細胞増殖を阻害しなかった。 CAPS の抗腫瘍作用は宿主の免疫システムを介しての結果であると推察した 。

12. ステップ ２ カシス・ポリサッカライド （ＣＡＰＳ）の生理活性向上

13. CAPS はもともとカシス果汁に含まれるもの（特許性弱い）。 他社商品と差別化（特許を取得）するためには・・・ ・・・CAPS 単位量あたりの免疫調節活性を上げるしかない。 そうすることで、生理効果の高いカシス商品を安価で消費者に提供できる。 仮説）特に、in vivoにおいては、至適 CAPS 分子量が存在する。 課題）CAPS 低分子化の際に、活性維持のために主要構造部分は分解　　　されないように、しかも、現場製造レベルでコントロール可能　　　なように、なるべくゆっくりと分解されることが重要。

14. MW 2,400 β-ｶﾞﾗｸﾄｼﾀﾞｰｾﾞ処理による CAPS 平均分子量推移（ゲルろ過分析） MW 19,000 MW 55,000 MW 230,000 Digested for 35 h Digested for 8 h Digested for 3 h Not digested 4 6 8 10 Retention time (min) 黄麹菌（Aspergillus oryzae）由来の β-ガラクトシダーゼ（本来、乳糖をブドウ糖とグルコースに分解する酵素）は ＣＡＰＳ の生理活性とはあまり関係のないペクチン部分（主成分はポリガラクツロン酸）を徐々に分解することを発見。

15. 120 100 80 TNF--inducing activity (%) 60 40 20 0 1000 100 10 1 Mean MW of digested CAPS (103) しかも、ヘミセルラーゼで消化したと場合と比較すると、CAPS の生理活性はあまり低下しない （in vitroＭφ 試験系）。 β-ｶﾞﾗｸﾄｼﾀﾞｰｾﾞ（Aspergillus oryzae）消化に伴う CAPS のｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性変化 ﾍﾐｾﾙﾗｰｾﾞ（Aspergillus niger）で完全消化した場合の CAPS のｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性変化 120 ＊＊：p<0.01， Mean ± S.E. 100 80 TNF--inducing activity (%) 60 活性約 80% 減少 Not digested Digested for 35 h(Completely digested) 40 20 ** 活性約 20% 減少 0 Beforedigestion Afterdigestion

16. 120 100 80 TNF--inducing activity (%) 60 40 20 0 1000 100 10 1 Mean MW of digested CAPS (103) そして、 in vivo においては、平均分子量約 20,000の部分分解 CAPS が最も強い免疫賦活効果（抗腫瘍効果）を発揮することを発見した。 部分分解 CAPS の抗腫瘍効果 β-ｶﾞﾗｸﾄｼﾀﾞｰｾﾞ（Aspergillus oryzae）消化に伴う CAPS のｻｲﾄｶｲﾝ誘導活性変化 3 * p < 0.05 2 * Tumor weight (g) MW 2,400(Completely digested) 1 MW 230,000(Not digested) MW 55,000 MW 19,000 0 PBS MW 2,400 MW 230,000(Not digested) MW 55,000 MW 19,000 （参考文献： Biosci. Biotechnol. Biochem. (2007) in press [一部改変] ）

17. 免疫系に影響を及ぼす多糖類に一般的に期待される効果は・・・免疫系に影響を及ぼす多糖類に一般的に期待される効果は・・・ 抗腫瘍、抗感染症、抗アレルギー、花粉症予防、その他 マウス抗アレルギー試験で効果を認める。（日本食品免疫学会 2006 年度大会にて発表） 次はヒトで・・・花粉症予防試験を実施。