第四章病毒和亚病毒

第四章病毒和亚病毒 • 概述 • 病毒的形态结构和功能 • 病毒的繁殖 • 亚病毒 • 病毒与实践

第一节概述 • 1892：俄国伊万诺夫斯基Ivanowski首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过细菌过滤器。 • 1898：荷兰贝哲林克Beijerinck证实该致病因子可以被乙醇从悬液中沉淀下来而不失去其感染性但用培养细菌的方法培养不出来；给这样的病原体起名叫virus。 • 1935：美国斯坛莱从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，又证实了结晶中含核酸和蛋白质两种成分，而只有核酸具感染和复制能力，并因此获得诺贝尔奖。 • 1952：Hershey和Chase证实噬菌体的遗传物质仅仅是DNA,开创了病毒分子生物学。 • 1971后：陆续发现了各种亚病毒——类病毒、朊病毒和拟病毒。

一、病毒的特点和定义 病毒区别于其他生物的主要特征：P63 • 形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察，一般都可通过细菌滤器 • 没有细胞构造，其主要成分仅是核酸和蛋白质两种，故也称分子生物 • 每一种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA • 既无产能酶系也无蛋白质合成系统，在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行增殖，不存在个体生长和二均等分裂等细胞繁殖方式 • 在宿主的活细胞内营专性寄生 • 在离体条件下，以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶 • 对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感

病毒的定义： • Luria(1968)－病毒是一种生物实体，其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制，并合成能将病毒基因组转移到其他细胞中去的特殊颗粒的核酸分子（DNA或RNA） • 向近敏（1983）－病毒是一种核蛋白分子，具有独立活动和演化的基因体系，须在活细胞内借助于细胞合成代谢体系，才能表达和繁殖，并装配成为一定的实体形式，以便从一个细胞传至另一个细胞。 • Fields（1990）－病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物，它的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化。

病毒是一种比较原始的、有生命特征的、能自我复制和专性寄生细胞内的非细胞生物。病毒是一种比较原始的、有生命特征的、能自我复制和专性寄生细胞内的非细胞生物。

二、宿主范围（分布）及重要性 几乎所有的生物都可以感染相应的病毒。根据宿主可以分三类：动物病毒植物病毒细菌病毒（或称噬菌体）

三、病毒的分类与命名 ——病毒的分类原则 • 病毒的形态 • 病毒粒体结构 • 病毒基因组 • 病毒的复制 • 病毒的化学组成 • 病毒抗原性 • 病毒的生物学性质

病毒的分类与命名 ——病毒的命名规则国际病毒分类委员会（ICTV）分类单元：目（order）成套病毒目（Nidovirales）科（family）冠状病毒科（Coronaviridae）属（genus）冠状病毒属（Coronavirus）种（species） SARS coronavirus

病毒的分类与命名 ——病毒的分类系统 dsDNA病毒 ssDNA病毒 dsRNA病毒 +ssRNA病毒 -ssRNA病毒逆转录病毒亚病毒因子 2001年第7次报告：3目，66科（包括2个类病毒科）、9亚科和244属4000多种

第二节病毒的形态和结构 • 病毒的大小 • 病毒的形态 • 病毒的构造 • 病毒的化学组成

一、病毒的大小 • 测定大小的单位是纳米（10－9)，多数病毒的直径在100nm以下（10～200nm） • 绝大多数病毒能通过细菌滤器 • 须用电镜才能观察到其具体形态和大小

A、大肠杆菌噬菌体 ( 65 ×95nm ) 衣原体 390nm 立克次体 450nm B、腺病毒 (70nm ) C、脊髓灰质炎病毒 (30nm ) G A 葡萄球菌 (1000nm） D、乙脑病毒 ( 40nm ) F 牛痘病毒 300×250nm E、蛋白分子 (10nm) B E C F、流感病毒 ( 100nm ) D G、烟草花叶病毒

二、病毒的形态 • 人、动物和真菌病毒多呈球状，少数为枪弹状或砖状 • 植物病毒和昆虫病毒多线状和杆状，少数为球状球形颗粒杆状颗粒复杂形状颗粒电镜 • 细菌病毒称噬菌体，部分为蝌蚪状，部分为线状或球状

三、病毒粒子的结构 病毒粒（病毒体，virion）：成熟的具有侵袭力的病毒颗粒衣壳：蛋白质－壳粒（蛋白亚基）组成核心：核酸核衣壳基本结构包膜：脂肪和蛋白质 p65 衣壳核酸包膜刺突裸露病毒衣壳粒包膜病毒

核心：核酸 →基因组genome →决定病毒遗传、变异 • 和复制 • 壳粒capsomere → 衣壳capsid →保护、介导、抗原性 • 包膜envelope，包膜子粒peplomere（刺突spike） →保 • 护、介导、抗原性

病毒粒的对称性 • 螺旋对称-------烟草花叶病毒(TMV) • 二十面体对称------------------腺病毒 • 复合对称-----------------T偶数噬菌体

①螺旋对称的病毒粒子 Tobacco Mosaic Virus

②二十面体对称病毒粒子 A.二重对称轴；B.三重对称轴；C.五重对称轴； E.12枚5联体和20枚6联体D .3个壳粒排列成20枚 3联体；；F.数目庞大的壳粒

二十面体对称的代表－腺病毒(Adenovirus) 具有20个面，30条边和12个顶角。核衣壳由不同数量的衣壳粒按一定方式排列成对称体。腺病毒粒子共由252个球形的衣壳粒排列成一个具有廿面的对称体，线状dsDNA。噬菌体 X174只有12个衣壳粒，最大的廿面体是由1，472个衣壳粒组成的昆虫病毒粒子。

③复合对称的病毒粒子

大肠杆菌T4噬菌体的模式图 a.游离的噬菌体； b.噬菌体的尾鞘收缩和尾管穿入细菌细胞

补充：病毒的群体形态 病毒的群体形态有：包涵体(inclusion body) 噬菌斑(plaque) 空斑(plaque) 枯斑(lesion)

（1）包涵体（inclusion body） 概念：感染病毒的宿主细胞内，出现在光学显微镜下可见的大小、形态、数量不等的小体，称为包涵体。在宿主细胞内形成包涵体是病毒的特征，不同的病毒其形成的包涵体具有不同的形态、结构、和特性。包涵体在细胞中的形成部位：位于细胞核内—如包疹病毒位于细胞质内—如狂犬病毒等胞核内胞质都有—麻疹病毒

包涵体（inclusion body） • 是病毒的聚集体; • 是病毒的合成部位; 是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质非病毒性包涵体,由化学因子或细菌感染形成包涵体的实践意义—-病毒鉴定、临床诊断依据。

噬菌斑(plaque) 噬菌体稀释液敏感菌+上层培养基噬菌斑噬菌斑敏感菌菌苔培养双层培养基下层培养基

空斑和病斑 在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑,称为病斑.因为受肿瘤病毒感染。空斑和病斑用于动物病毒粒子的计数也可以采用噬菌斑法类似的技术。

四、化学组成 病毒的主要成分为核酸(DNA或RNA)和蛋白质。有的病毒还含有脂质、糖类等其他组分。

1.病毒的核酸 一种病毒只含有一种核酸（DNA或RNA）。植物病毒绝大多数含DNA;少数含RNA；动物病毒一部分含DNA，一部分含RNA；细菌病毒普遍含DNA，含RNA的极少。病毒的核酸类型极为多样化：病毒的DNA与RNA均有单链和双链：注：将碱基序列与mRNA一致的核酸单链定位正链，将碱基序列与mRNA互补的核酸单链定位负链 +ssDNA -ssDNA +ssRNA -ssRNA dsDNA ssDNA ssRNA dsRNA 线状环状

2.病毒的蛋白质 构成一个完整的、形态成熟的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白、包膜蛋白和存在于病毒体中的酶等。结构蛋白(structural protein) 病毒蛋白质非结构蛋白(non-structural protein) 由病毒基因组所编码的,但并不结合于病毒颗粒中的蛋白质,如复制酶和装配酶等。

3.其他成分 • 一些较复杂的病毒（如包膜病毒）除含有核酸和蛋白质两种成分外，还含有脂类、多糖等其他成分。 • 病毒中的脂类主要以脂质双分子层的形式存在于病毒的包膜中。 • 病毒所含的糖类主要以糖蛋白的形式存在于包膜的表面，决定着病毒的抗原性。

第三节病毒的繁殖 病毒是专性活细胞内寄生物，缺乏生活细胞所具备的细胞器以及代谢必需的酶系统和能量。繁殖所需的原料、能量和生物合成的场所均由宿主细胞提供，在病毒核酸的控制下合成病毒的核酸(DNA或RNA)与蛋白质等成分，然后在宿主细胞的细胞质或细胞核内装配为成熟的、具感染性的病毒粒子，再以各种方式释放至细胞外，感染其它细胞。

一、噬菌体的繁殖 （一）噬菌体的形态结构与组成 1、组成：主要由蛋白质和核酸组成。 2、基本形态：蝌蚪形、微球形和纤丝形。

★T-系噬菌体——T-系噬菌体是研究的最广泛而又深入的细菌噬菌体，按发现的先后顺序进行从T1---T7编号，后来发现其中偶数者的形态都相同（蝌蚪形收缩性长尾），故统称T偶数噬菌体。★T-系噬菌体——T-系噬菌体是研究的最广泛而又深入的细菌噬菌体，按发现的先后顺序进行从T1---T7编号，后来发现其中偶数者的形态都相同（蝌蚪形收缩性长尾），故统称T偶数噬菌体。

3、蝌蚪形噬菌体的构造 以大肠杆菌T4噬菌体为例头部：廿面体对称结构，由蛋白质衣壳构成，内含一条DNA。颈部：薄盘状，附颈须。尾鞘：长95nm, 衣壳粒螺旋对称；可伸缩。尾髓:中空，DNA可由此进入细胞。基板:六角形盘状物，其上有刺突、尾丝。刺突:有吸附功能。尾丝:有识别吸附功能。大肠杆菌T4噬菌体构造

（二）、噬菌体(phage)的繁殖 噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体. 温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。

1、烈性噬菌体的繁殖 烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：即吸附、侵入、增殖、装配和释放。

①吸附(adsorption) 噬菌体对宿主细胞的吸附具高度的特异性。吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。

影响吸附的因素：噬菌体数量；阳离子浓度；温度；辅助因子（色AA、生物素）等。影响吸附的因素：噬菌体数量；阳离子浓度；温度；辅助因子（色AA、生物素）等。自外裂解：大量噬菌体吸附在同一细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因导致细胞裂解。

②侵入(penetration) 头部的核酸通过中空的尾髓压入细胞内，而蛋白质外壳则留在细胞外。尾鞘的收缩性可明显提高噬菌体核酸注入的速率。

③增殖 (replication) 包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。增殖是通过噬菌体基因表达实现的。核酸的复制与病毒蛋白质的合成是分开进行的。

病毒核酸的复制 病毒核酸链接入寄主核酸链病毒核酸复制

④装配： 主要步骤有： DNA分子的缩合——通过衣壳包裹DNA而形成头部——尾丝及尾部的其它部件独立装配完成——头部与尾部相结合——最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。

⑤ 裂解（释放） 被感染细胞裂解，成熟的子代噬菌体转移到外界。开始新的生活史。裂解量：平均每一宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体数。通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100～300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长。

2、噬菌体效价的测定 效价（噬菌斑形成单位数、感染中心数）：每ml样品中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。测定方法：斑点试验法、液体稀释管法、单层平板法、双层平板法、快速玻片法

菌液+噬菌体试样+琼脂培养基 培养10余小时琼脂平板计数噬菌斑双层平板法噬菌斑数=试样中噬菌体数

2、一步生长曲线 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 • 实验设计依据：1个菌体被1个噬菌体感染,避免二次吸附；细菌群体被噬菌体同步感染。 • 实验过程（自然裂解）: • 敏感菌10ml Phage 1ml • 混匀，5min,使之吸附 • 离心或用抗phage血清处理, 去除过量phage • 高倍稀释,吸附phage的菌悬液(避免多次吸附) • 37℃培养,定时取样

取样人为裂解处理（每5min） 样品中加入氯仿裂解细胞裂解液加入敏感菌液中适当稀释混合液涂布于琼脂培养基上 24-48h 计数噬菌斑

噬菌斑: 概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。) 应用:噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。噬菌斑形成的过程和原理是：噬菌体侵染敏感细胞后，释放子代噬菌体，通过培养基扩散到四周细胞，继续侵染，引起连锁细胞裂解，从而形成形态和大小不同的空斑。

以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标,绘制成的曲线为一步生长曲线。以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标,绘制成的曲线为一步生长曲线。可分以下阶段：潜伏期裂解期稳定期

潜伏期：从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放 新的噬菌体之前的这段时期.曲线平行于横轴，噬菌体数无变化.样品中无游离的噬菌体。(潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数,也就是感染噬菌体的细菌数). 裂解期：曲线直线上升,子代噬菌体不断释放到培养基中,直到达到一个极限. 稳定期:感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。

第四章 病毒和亚病毒