Characterization of Human Exonuclease 1

1. Characterization of Human Exonuclease 1

2. Præsentation • Baggrund • Gennemgang af DNA mismatch repair • Mismatch repair og cancer • Resultater • Afslutning

3. RAD2 nuclease familien Klasse I (Human XPG) Klasse II (Human FEN1) Klasse III (Human EXO1)

4. DNA replikation: - Fjerne RNA primere Recombination: - 5’3’ processering af DSB - Fjerne intermediære strukturer - Mismatch repair Human exonuclease I • 5’-3’ exonuclease • RNase H aktivitet • Flap endonuclease

5. Human Mismatch repair ? DNA pol  DNA pol 

6. hEXO1 og Mismatch repair • gær EXO1 mutanter udviser mutator fænotype • hEXO1 interagerer med hMSH2, hMSH3 og hMLH1 • hEXO1 udtrykkes i delende celler • hMutS og hMutL kan regulerer hEXO1’s aktivitet • MMR proteiner nødvendige for 3’5’ aktivitet

7. hEXO1 i Mismatch repair

8. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)

9. Gener muteret i HNPCC hMSH2 hMSH6 hMLH1 hPMS1 hPMS2

10. Gener muteret i HNPCC hMSH2 hMSH6 hMLH1 hPMS1 hPMS2

11. Gener muteret i HNPCC hMSH2 hMSH6 hMLH1 hPMS1 hPMS2 Germline mutation i kendte MMR gener identificeres ikke i 30% af HNPCC tilfælde

12. hEXO1 og HNPCC Germline mutationer identificeret i hEXO1 hos patienter med atypisk HNPCC MSI i tumorer fra patienter med hEXO1 mutationer

13. Forskellige pathways – samme resultat Ændret protein interaktion Ændret nuclease aktivitet hEXO1 mutation Cancer Ændret protein stabilitet Ændret sub-cellulær lokalisering

14. To splice varianter af human exonuclease 1 hEXO1b (846 aminosyrer) HEX1 (803 aminosyrer) Interaktions regioner

15. At karakterisere HEX1 og seks HEX1-mutanter med hensyn til: • Sub-cellulær lokalisering protein-protein interaktioner protein processering Projektets formål • At undersøge cadmiums indflydelse på MMR komplekser

16. Sub-cellulær lokalisering af YFP-HEX1 og YFP-hEXO1b YFP-HEX1 YFP-hEXO1b

17. Co-lokalisering af YFP-HEX1 og CFP-PCNA

18. Placering af HEX1 mutationer

19. Sub-cellulær localisering af YFP-HEX1 mutanter YFP-HEX1-V27A YFP-HEX1-R354H YFP-HEX1-L410R YFP-HEX1-T439M YFP-HEX1-K589E YFP-HEX1-G670E

20. Opsummering • HEX1 lokaliserer til kernen og co-lokaliserer med PCNA ligesom hEXO1b • Alle seks HEX1-mutanter lokaliserer til kernen

21. 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Pull down assay med HEX1 og hMLH1 eller hMSH2 HEX1 og hMLH1 HEX1 og hMSH2 HEX1 HEX1

22. Kort af hMLH1

23. Kort af hMSH2

24. Pull Down med tre proteiner

25. Pull down assay med HEX1, hMSH6 og hMSH2 GST-hMSH2 X X X X X X X X X Labeled hMSH6 X X XX X XX X XX X Unlabeled hMSH6 X X X XX X XX Labeled HEX1 X XX Unlabeled HEX1 hMSH6 HEX1 1 2 3 4 5 6 7 8 9

26. HEX1 mutanter og hMLH1 HEX1 Mutants HEX1-L410R HEX1-R354H HEX1-K589E HEX1-G670E HEX1-V27A HEX1-T439M HEX1 mutanter og hMSH2 HEX1 Mutants HEX1-L410R HEX1-K589E HEX1-R354H HEX1-V27A HEX1-G670E HEX1-T439M Pull down med HEX1-mutanter og hMLH1 eller hMSH2

27. Pull down med HEX1 mutanter, hPMS2 og hMLH1 GST-hMLH1 X X X X X X X X X Labeled hPMS2 X X XX X XX X XX X Unlabeled hPMS2 X X X XX X XX Labeled HEX1- mutant X XX Unlabeled HEX1-mutant hPMS2 HEX1-L410R 1 2 3 4 5 6 7 8 9 hPMS2 HEX1-T439M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

28. 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 Pull down med HEX1 mutanter, hMSH6 og hMSH2 GST-hMSH2 X X X X X X X X X Labeled hMSH6 X X XX X XX X XX X Unlabeled hMSH6 X X X XX X XX Labeled HEX1 mutant X XX Unlabeled HEX1 mutant hMSH6 HEX1-L410R hMSH6 HEX1-T439M

29. Opsummering • HEX1 interagerer med hMLH1 og hMSH2 ligesom hEXO1b • HEX1 danner tertiært kompleks med hMSH2-hMSH6 (hMutS) • Alle seks HEX1 mutanter interagerer med hMLH1 og hMSH2 • HEX1-L410R og HEX1-T439M danner tertiært kompleks med hMLH1-hPMS2 (hMutL) og hMSH2-hMSH6 (hMutS)

30. Protein processering

31. Protein processering SDS gel Nativ gel HEX1 L410R T439M HEX1 L410R T439M 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

32. Protein processering SDS gel HEX1 L410R T439M S P S S P S S P S

33. hMLH1-hPMS2 hMLH1-hEXO1 hMLH1-hPMS2-hEXO1 hMSH2-hMSH6 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6 hMSH2-hEXO1 hMSH2-hMSH6-hEXO1 Pull down med cadmium 15µM Cadmium 5µM Cadmium hPMS2 hEXO1 hPMS2 hEXO1 hPMS2 hEXO1 hPMS2 + Cd hEXO1 + Cd hPMS2 + Cd hEXO1 + Cd hPMS2+ hEXO1 hPMS2+ hEXO1 hPMS2 + hEXO1 + Cd hPMS2 + hEXO1 + Cd hMSH6 hEXO1 hEXO1 hMSH6 hEXO1 hMSH6 hEXO1 + Cd hMSH6 + Cd hMSH6+ hEXO1 hEXO1 + Cd hMSH6 + Cd hMSH6+ hEXO1 hMSH6 + hEXO1 + Cd hMSH6 + hEXO1 + Cd

34. hEXO1b og HEX1 er ens i forhold til • Sub-cellulær lokalisering • Co-lokalisering med PCNA • Protein interaktion med hMLH1 og hMSH2 • HEX1 danner tertiært kompleks med hMSH2 og hMSH6 • HEX1 mutanterne V27A, R354H, L410R, T439M, K589E og G670E lokaliserer til kerne og interagerer med hMLH1 og hMSH2 • HEX1 mutanterne L410R og T439M danner tertiært kompleks med hMSH2-hMSH6 (hMutS) og hMLH1-hPMS2 (hMutL) • Ingen ændret processering af HEX1-L410R og HEX1-T439M Cadmium forhindrer ikke dannelsen af hMLH1-hPMS2 hMLH1-hEXO1 hMLH1-hPMS2-hEXO1 hMSH2-hMSH6 hMSH2-hEXO1 hMSH2-hMSH6-hEXO1 Konklusion

35. hEXO1 mutation MMR mutation Weak mutator phenotype Weak mutator phenotype Strong mutator phenotype HNPCC hEXO1 og cancer hEXO1 mutation Weak mutator phenotype Low penetrance Late onset HNPCC and/or sporadic cancer

36. Future work • Protein interaktioner i gær to-hybrid systemet • Bindings konstater for MMR proteiner • Relative bindings styrker • HEX1 og HEX1-mutanters nuclease aktivitet • Kombinere hEXO1 mutanter og andre MMR mutanter i funktionelle assays

37. The End