第三章 DNA 的复制与损伤修复 Replication and Repair of DNA

1. 第三章 DNA的复制与损伤修复Replication and Repair of DNA

2. 本章主要内容 目的要求 一、DNA的半保留复制 二、DNA复制的起点与方向 三、DNA的半不连续复制 四、与DNA 复制有关的蛋白质 五、大肠杆菌DNA的复制过程 六、复制起始的时序控制 七、真核生物DNA复制特点 八、DNA损伤的修复

3. 目的要求 1. 掌握遗传信息传递的中心法则。 2.  掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、 DNA的半不连续复制的概念。 3.  了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物DNA的复制过程。 4.  了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制： 错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修 复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要 的酶类；了解DNA损伤修复的意义。

4. 转录 翻译 DNA RNA 蛋白质 逆转录 复制 病毒（复制） 中心法则： 1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。 1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录 RNA的复制存在于RNA病毒 DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。

5. 几个基本概念： • 复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 • 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 • 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。 • 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。

6. 中心法则图示 Reverse transcription

7. 一、DNA的半保留复制 1.定义： 以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。 2.半保留复制的实验证据: 1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。

8. DNA复制的可能方式 半保留复制 全保留与全新复制 分散复制

9. DNA半保留复制图示：

10. 半保留复制的证明： • Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。

11. 15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度

13. 亲代DNA（15N～15N） 子一代DNA（15N～14N） 子二代DNA (15N～14N，14N～14N 1:1) 子三代DNA (15N～14N，14N～14N 1:3) 子四代DNA (15N～14N，14N～14N 1:7 ) 亲代DNA与子二代DNA的混合物 亲代DNA与子四代DNA的混合物

14. 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

15. DNA的半保留复制的生物学意义： • DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。 • DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。

16. 双向复制 单向复制

17. 二、DNA复制的起点与方向

18. 复制中的DNA 复制原点 复制叉

19. DNA复制的主要方式 3 • 大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制） • 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制） • 单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状） • 不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）

20. 三、DNA复制的半不连续性 前导链：以3’ → 5’ 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。 前导链 冈崎片段 滞后链：以5’ →3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。 滞后链

21. 半不连续复制的发现 • 1968日本学者冈崎： 同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌 短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。→证明DNA复制中有小片段合成。 测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。

22. 四、与DNA复制有关的酶和蛋白质 (一) DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下： • 原料：四种脱氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP dCTP dTTP) • 需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。 • 需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆 菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含 3’ -OH. • 合成方向：5   3 

23. （二）大肠杆菌DNA聚合酶 1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有: （1）5  3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3  5’外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）； （3）还具有5 3’外切酶活性（双链有效）； 该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。

24. DNA聚合酶催化的反应：

25. DNA聚合酶Ⅰ的功能 Ⅰ

26. Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 "for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"

27. 2、DNA聚合酶Ⅱ： 多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’ 5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。

28. 3、DNA聚合酶Ⅲ 多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。

29. DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成

30. DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体 滞后链的合成 前导链的合成

31. DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图 DNA双螺旋

32. 大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 大肠杆菌三种聚合酶比较

33. (三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口 作用特点： • 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。 • DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。

34. DNA连接酶作用机理

35. (四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)

36. 1、拓扑异构酶 拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。

37. 两类拓扑异构酶作用特点: • 拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 • 拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。 二者共同控制DNA的拓扑结构。

39. 2、解螺旋酶 （解链酶） 通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 3、单链结合蛋白： 稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。

40. 3、引物合成酶与引发前体 • 引物合成酶：催化引物RNA的生成 • 引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。 引发体可以沿模板链5’ 3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量， n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。

41. （五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图

42. 五、 DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例） • 复制的起始 1、起始复合物的形成：称为引发 2、RNA引物的合成 • 链的延伸： • 复制的终止：

43. 复制原点oriC和原点的识别： • DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori C(或o）表示。大肠杆菌的复制原点ori C由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。 • 复制原点由DnaA蛋白识别， 在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π 、 SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。 • 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。

44. （一）复制起始 1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。 3、在类组蛋白（HU、ATP参与下, Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。 4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5’ →3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。

46. (二) 链的延长（冈崎片段的合成） • 真核生物的冈崎片段为：100-200bp • 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp

47. 前导链 • 滞后链 • 冈崎片段 • 半不连续复制 冈崎模型 DNA链的延伸 在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’ -脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。

48. 冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:

49. 前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）