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根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化

植物生物技术实验. 根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化. 实验五. 2012 年 4 月 17 日. 植物遗传转化. 植物遗传转化：外源基因转移到植物体内并 稳定整合、表达与遗传 的过程。 常用方法： 农杆菌介导法 基因枪法 花粉管通道法 ……. 根癌农杆菌介导法. 细菌； 能够感染植物特别是 双子叶植物； 含有一个以上的质粒（ Ti 质粒，核外遗传单位）；感染植物后， Ti 质粒的 DNA 片段导入植物基因组中。. Ti 质粒. Ti 质粒：环状 DNA 分子，包括 T-DNA 区 ；两端各有 25bp 的边界序列；

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根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化

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Presentation Transcript

  1. 植物生物技术实验 根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化 实验五 2012年4月17日

  2. 植物遗传转化 • 植物遗传转化：外源基因转移到植物体内并稳定整合、表达与遗传的过程。 • 常用方法： • 农杆菌介导法 • 基因枪法 • 花粉管通道法 • ……

  3. 根癌农杆菌介导法 • 细菌； • 能够感染植物特别是双子叶植物； • 含有一个以上的质粒（Ti质粒，核外遗传单位）；感染植物后，Ti质粒的DNA片段导入植物基因组中。

  4. Ti质粒 • Ti质粒：环状DNA分子，包括 • T-DNA区；两端各有25bp的边界序列； • Vir 区，调控T-DNA加工和转移；分VirA、B、C、D、E、G、H 等7-8个操纵子，一共有24个基因； • Con区，调控细菌间结合转移的相关基因； • Ori 区，调控Ti质粒的自我复制起始。 • Vir区、根癌农杆菌染色体上的毒性相关位点和T-DNA边界序列是T-DNA转移必需的。

  5. T-DNA整合过程 农杆菌附着在植物伤口，形成纤维小丝固定在植物细胞壁 受伤的植物形成酚类等诱导物质 一系列Vir基因表达；剪切T-DNA（从右边界到左边界）并最终形成T-链蛋白复合体 T-链蛋白复合体经细菌细胞膜、细胞壁、植物细胞壁、细胞膜、核膜进入细胞核，以单或多拷贝形式随即整合到植物染色体 T-DNA表达，植物产生冠瘿瘤

  6. 根癌农杆菌介导法 外源目的基因 真核生物启动子 选择基因 报告基因 体外连接到质粒中 质粒转化进入根癌农杆菌 农杆菌感染植物外植体 选择基因：选择性标记基因，给予转基因植物抗性，非转基因细胞死亡，抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。 报告基因：快速报告植物材料是否被转化，表达产物非常容易被检测的基因，常用GUS（β-葡萄糖醛酸苷酶基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）等。 真核生物启动子：用于目的基因、选择报告基因在宿主细胞的启动表达，一般为花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子

  7. 选择基因 真核启动子 报告基因

  8. 农杆菌介导的基因工程基本程序 载体构建 （目的基因、筛选报告基因、启动子连接到T-DNA） 载体向农杆菌转化 受体植株材料（叶盘） 含有目的载体的农杆菌 农杆菌侵染植物 共培养 脱菌培养 形成愈伤组织/不定芽/体细胞胚 筛选培养 植株再生 检测 转基因植株

  9. 重点步骤 1、农杆菌的培养与侵染菌液的制备 • 培养基：YEP、YEB、LB，加Kan • 培养天数：对数生长 • 侵染菌液：离心收集，以培养基稀释，OD600=0.05~0.7 2、植物受体材料的准备 • 叶片、愈伤组织、胚轴、子叶等，敏感细胞 • 预培养（适应离体环境，非必须） 3、侵染 • 将切割成小块的外植体浸泡在制备好的菌液中，（以无激素MS或无菌水漂洗后）放在无菌吸水纸上吸干 • 侵染时间：数分钟

  10. 重点步骤 4、共培养 • 诱导物：乙酰丁香酮AS，Vir区基因活化物 • 时间：>16h才能诱发毒性反应，过长毒害 • 暗培养 5、筛选培养： • 筛选培养：选择标记基因，Kan，筛选转基因细胞 • 脱菌培养：杀死和抑制农杆菌，含有能杀死农杆菌的抗生素的培养基，常用羧苄青霉素Carb 6、再生植物的检测 • 报告基因等

  11. 转基因是否成功的检测方法 1、选择基因在培养阶段的筛选作用 2、报告基因的初步检测 3、分子检测 • 基因水平：PCR检测、Southern Blot ； • RNA水平：RT-PCR，Northern Blot； • 蛋白质水平：表达蛋白的分离纯化，血清学反应、Western Blot； 4、性状分析

  12. 报告基因检测

  13. 分子检测 PCR检测：以目的基因为引物，以转基因植物基因组DNA为模板进行体外扩增

  14. 分子检测 Southern Blot 检测：以外源目的基因序列作为探针，与转基因植物基因组DNA进行杂交。检测外源基因的存在及其拷贝数

  15. 分子检测 RT-PCR检测：以转基因植物总RNA为模板进行反转录，在经PCR扩增，如果从细胞总RNA得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录

  16. 思考题： 1、高效遗传转化体系建立的基础是？ 高效遗传表达载体的选择和载体构建 受体再生及转化体系的建立和优化 2、根癌农杆菌介导的遗传转化的影响因素有哪些？ 农杆菌：基因型、制备、保存 受体材料：基因型、生理状态 转化过程：预培养，侵染（方式、时间、浓度），共培养（培养基、温、光、pH、激素、诱导物）

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