Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS

1. Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS MVDr. Katarína Domaracká, PhD. MVDr. Monika Novikmecová MUDr. Iveta Fandáková MUDr. Zuzana Szövényiová

2. Princíp: PCR-polymerázová reťazová reakcia Polymerázová reťazová reakcia (PCR, polymerase chain reaction) umožňuje selektívne zmnoženie (amplifikáciu) určitej oblasti DNAspôsobom podobným in vivo DNA replikácii, pričom veľkosť amplifikovaného úseku ohraničujú dva oligonukleotidy – primery. (1985, Kary Mullis)

3. Cieľová dvojvláknová DNA Mechanizmus PCR reakcie Počiatočná denaturácia DNA 94-95°C, 5´ “Annealing” primerov 30-60°C, 30´´ Primery sú predĺžované prostredníctvom aktivity Taq polymerázy Nové reťazce 74°C, 2-5´ ´n´cykly sa opakujú Denaturácia DNA 95°C, 30´´

4. VZORKA IZOLÁCIA DNA, RNA AMPLIFIKÁCIA DETEKCIA

5. Využitie PCR v diagnostike infekčných ochorení baktérie Bordettella pertusis, Borrelia burgdorferi, Mycoplasma sp., Chlamydia sp., Ureaplasma sp., Neisseria gonorhoeae, Mycobacterium sp........ vírusy CMV, HSV, EBV, rotavírusy, adenovírusy papilomavírusy, hepatitída B a C... fungi faktory virulencie, gény rezistencie

6. CSFako vzorka pre PCR • jedna z najúspešnejších aplikácií PCR pri diagnostike infekcií CNS • PCR- ideálna pre dg. ťažko kultivovateľných mikroorganizmov • možnosť pozitívneho nálezu aj po aplikácii nízkych dávok antivirotík (inhibujú tradičné kultivácie) • časová výhoda oproti sérologii (tvorbaprotilátok trvá 2-4 týždne), PCR zachytí vírus v čase najvyššej replikácie

7. Senzitivita PCR v CSF • nízka senzitivita (falošná negativita) príčiny: - nízka hladina vírusu vo vzorke - „clearance“- silné neutralizujúce protilátky - inhibítory = produkty rozpadu erytrocytov !PCR neovplyvňuje xantochrómia, vysoká hladina bielkovín a leukocytov !!!

8. Špecificita PCR v CSF • pozitívny výsledok indikuje prítomnosť nukleovej kyseliny vírusu (súčasná alebo pretrvávajúca vírusová infekcia) • Výnimky! (pozitívny výsledok neindikuje vírusovú infekciu – falošná pozitivita) - porušenie hematoencefalickej bariéry (bakteriálna meningitída, kontaminácia krvou) - prítomnosť infikovaných Leu (CMV)

9. Diagnostika herpesvírusových infekcií CNS !Zlatý štandard pre diagnostiku herpesvírusových infekcií CNS! (DeBiasi a kol, 2004) problém: pretrvávanie latentných herpesvírusov u zdravej populácie (ich genóm je cieľ pre PCR) !Dôležité zvážiť výskyt pozitívneho nálezu!

10. Herpes simplex vírus 1 a 2 • HSV1 aj HSV 2 – najčastejšia komplikácia postihnutie CNS • HSV1 – najčastejšia endemická encephalitis v rozvinutých krajinách • pozitívny PCR výsledok pre HSV (1/2) korešponduje vždy s klinickým obrazom a je „gold standard“ pre diagnózu, s približne 96% senzitivitou a 99% špecificitou (Boivin a kol. , 2004)

11. Kinetika HSV pozitivity v CSF • prvotné štúdie – pozitívny výsledok hneď po infekcii • novšie - 3 z 11 pac. negatívny výsledok počas prvých 72 h • nevhodné hodnotiť negatívny výsledok počas prvých 72 hodín, PCR test má byť opakovaný na 4 až 7 deň po objavení symptómov • nevhodné prerušiť terapiu antivirotikami na základe negatívneho výsledku do 72 hod. (Weil a kol, 2002) • u pacientov so symptómami viac ako jeden až dva týždne simultánne PCR a sérologia

12. Vplyv terapie na PCR pozitivitu HSV v CSF • Lakemann a kol. dĺžka antivirot. terapie: - 1 týždeň – žiaden vplyv na pozitivitu - 8-14 dní - 47% pozitivita - viac ako 2 týždne - 21% pozitivita • ak je PCR pozitívna 10 až 14 dní po ukončení terapie acyklovirom – ďalšia terapia (Cinque a kol. 2002)

13. PCR diagnostika CMV • kvalitatívna : latentní nosiči • moč,krv + EDTA (!nie citrát ani heparín!),CSF • plodová voda, punktáty, BAL, stery oko, sliny !Problém: odlíšiť latentnú a akútnu infekciu na základe PCR diagnózy! • kvantitatívna PCR (real-time PCR) • monitoruje fluorescenciu emitovanú počas reakcie ako indikátor produkcie amplikónov v každom PCR cykle (v reálnom čase) • umožňuje kvantifikovať hladinu virémie v krvi, čím nepriamo monitoruje účinnosť terapie

14. EBV • hodnotenie pozitívneho PCR výsledku EBV v CSF je stále nejasné • DNA EBV je často detekovaná aj pri absencii neurologických porúch • Výnimka! AIDS - associated primary CNS lymfoma (citlivosť 83-100 %) (špecificita 88-100%) (Boivin a kol. 2004)

15. CSF- manipulácia a odosielanie • pre analýzu potrebné minimálne množstvá CSL, senzitivita závislá na objeme vzorky • 200 - 300 ul – ideálne množstvo • optimálne - čerstvé vzorky doručené čo najrýchlejšie po odbere! • krátkodobé skladovanie -20°C, (1-2 dni)

16. Pomocou metódy PCR vyšetrujeme aj nasledujúce patogény: • Chlamydia trachomatis • Ureaplazma urealyticum + parvum • Mycoplasma spp. (Mge+Mho+Mpn+Mfe+Mpe) • HPV „high risk“ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45) • Neiseria gonorhoeae • Pneumocystis jiroveci (pôv. carinii, 4. porcia BAL)

17. Lymská borelióza (LB) • Borrelia burgdorferi sensu stricto (USA) • Borrelia garini • Borrelia afzelii • rád Spirochaetales gramnegatívne,špirálovité mikroaerofilné ťažkokultivovateľné baktérie • antropozoonóza (kliešte, lietajúci a savý hmyz) • unikátna baktéria z mikrobiologického aj z molekulárneho hľadiska (najviac plazmidov), umožňuje jej prežiť v prostredí bezstavovcov aj stavovcov Európa – B. senzu lato

19. Nepriama - sérologická diagnostika 1. stupeň (IF, ELISA)detekciaIgM a IgG protilátok - ELISA IV generácia, obsahuje VslE atg príp. jeho konzervatívnu doménu C6 - v ojedinelých prípadoch pozorujeme skríženú reaktivitu s EBV, iné herpetické alebo spirochétové infekcie 2. stupeň IMUNO BLOT ( Western blot) - konfirmácia špecificity protilátok !!!! - v prípade nepriekaznej klinickej symtomatológie a pozitivity protilátok v sérologických reakciách

20. western blot-v prípade nepriekaznej klinickej symtomatológie a pozitivity protilátok v sérologických reakciách Antigén p100 p58 BmpA VlsE OspC p41i DbpA - IgM - OspC - tvorí sa po vniknutí do organizmu Bičíkové proteíny (flagelín p41) - IgG - VslE – lipoproteín,zodpovedá za únik pred imunitou má kozervatívnu doménu C6 DbpA (Osp17, p18), DbpB OspA + OspB - povrchové proteíny ktoré borélia tvorí aby unikla imunite kliešťa, prípadne imunite hostiteľa Obr. IgG imunoblot pacientov s neuroboreliózou (Wilske a kol.2007)

21. LB-priama diagnostika • PCR –plazmidová, chromozomálna DNA • biopsia kože, moč – - v štádiách EM (erytema migrans) a ACA (acrodermatitis chronica atroficans) - vysoká senzitivita • synoviálna tekutina – vysoká senzitivita • CSF -odporúča sa vo včasných štádiách LNB - najvyšší záchyt DNA borelií je do 6týždňov od výskytu prvých symptómov ochorenia - v neskorších štádiách neuroboreliózy senzitivita metódy klesá (EFSN guidelines, 2010) !!!!!!PRE PCR DIAGNOSTIKU LB SA NEODPORÚČA POUŽIŤ KRV ANI SÉRUM!!!!!!!

22. Výhody PCR v diagnostike infekčných ochorení • vysoká senzitivita (1-10 baktérií 10-100 PFU/vzorka) • vysoká špecificita (daná sekvenciou primerov) • minimálne množstvo vzorky (výnimka moč) • detekcia perzistentných infekcií, asymtomatických infekcií • detekcia ťažko kultivovateľných mikroorganizmov • rýchlosť

23. Nevýhody PCR • INTERPRETÁCIA • informácia len o kvalite (!výnimka kvantitatívna PCR!) !to znamená DNA je, alebo nie je vo vzorke prítomná! neinformuje o: - imunitnej odpovedi organizmu - citlivosti na antibiotiká • detekuje aj prítomnosť mŕtvych mikroorganizmov vo vzorke (Chlamydia trachomatis viac ako 3 týždne po ukončení liečby doxycyklínom, Bauwens a kol. 1993) • vysokériziko kontaminácie pri odbere a spracovaní vzorky • prítomnosť inhibítorov vo vzorke (talk, heparín...), falošne negatívne výsledky (duplicita odberu) • finančná a technologická náročnosť

24. avilab@avilab.sk Adresa: Rastislavova 43 Košice Tel. kontakt: 055 / 615 23 74 615 23 75 615 23 76