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NK 细胞毒检测

NK 细胞毒检测. 王飞 周艳 E-mail ： fei@jlu.edu.cn E-mail ： julysec@jlu.edu.cn. 主 要 内 容. 实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定. 器材 75% 酒精 若干 无菌纱网 1 块 / 组 无菌平皿 1 块 / 组 无菌吸头（大、中、小） 3 盒 /room 无菌 96 孔培养板 1 块 / 组 可调微量加样器 1 套 / 组 细胞计数板 1 套 / 组

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NK 细胞毒检测

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Presentation Transcript

  1. NK细胞毒检测 王飞 周艳 E-mail：fei@jlu.edu.cn E-mail：julysec@jlu.edu.cn

  2. 主 要 内 容 • 实验分组及材料 • 实验原理 • 检测方法 • 主要操作步骤 • 结果判定

  3. 器材 75%酒精 若干 无菌纱网 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）3盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 1套/组 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 1套/ 组 细胞培养箱 1台/room 酶标仪 1台 离心机 2个/room 超净台 1台/组 动物、细胞及试剂 小鼠 1只/组(NS,OVA) YAC-1 1*106 * 2ml 培养液（DMEM) 无FCS 4ml/ 组 培养液(DMEM)10%FCS 10ml/组 LDH底物 3ml/组 柠檬酸（终止液） 1ml/组 实验分组及材料 分组： 每组4人 1只小鼠

  4. 原 理 • NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 • NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 • YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。

  5. NK细胞分离方法 • 密度梯度离心 • Ficoll 密度梯度离心 • Percoll密度梯度离心 • 磁化细胞分离器分离法

  6. 常用的检测方法 • 同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR • 乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用)

  7. 同位素释放法 S G0 G1 New DNA Or Protein Na251CrO4、3H-TdR、125I-UdR cpm

  8. 同位素释放法 • 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)，即可计算出NK细胞毒活性。

  9. 乳酸脱氢酶释放法-原理 乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。

  10. 乳酸脱氢酶释放法 无色底物 LDH底物 靶细胞 YAC-1 靶细胞 膜损伤 LDH 释放到细胞外 NK 杀伤 还 原 有色物质 测OD570值 杀伤率( %)= 实验值-自发释放值 ×100 Max- S自发 最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值

  11. 操作流程 培养YAC－1细胞 ＋10%FBS1640培养液 无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640（无FBS) 调细胞浓度 1×106/ml 细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝 加板(三复孔) (加法见附图) 调细胞浓度 1×107 /ml 1W 5%CO2 37℃培养2小时 30l /孔 1mol/L柠檬酸 离心，取100ul上清移入新孔， 37℃孵育10min 酶标仪测吸光度值：OD570nm 加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min 结果判定：

  12. 实验步骤 • 单细胞悬液的制备 • 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 • 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 • 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 • 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 • 细胞计数： • 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 • 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml • 调YAC－1细胞浓度至1×105/ml，每组需2ml 注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。

  13. 实 验 步 骤 • 细胞培养： • 按图所示加板。 • 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱中，培养2小时。 • LDH底物： • 在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。 • 室温避光保存15min。 • 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 • 结果测定： • 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。 • 结果判定： • Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值 • S自发（靶细胞自发释放） =自发释放孔均值-培养基对照孔均值 • 注： S自发 ＜0，做“0”处理 SI= 实验孔值-自然释放孔值 ×100% Max- S自发

  14. B,C,D A 实验孔值-自然释放孔值 SI= ×100% Max- S自发 加 板 方 法 Max=E-F S自发=A-G

  15. 结 果 处 理 • 算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标为E:T,纵坐标为SI值。 • 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用Excel作的图一起贴到实验记录本上。 • 要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。

  16. Excel 作 图

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