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方勇飞简介 主任医师、教授、 博士研究生导师 第三军医大学西南医院

方勇飞简介 主任医师、教授、 博士研究生导师 第三军医大学西南医院 中西医结合科与风湿病专科主任. 学术任职： 中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员 中华中医药学会风湿病分会常务委员 中华医学会风湿病分会委员 中国医师协会风湿免疫科分会常务委员 重庆市医学会风湿病专业委员会主任委员. 盐酸青藤碱（正清风痛宁） 的作用机理及临床应用. 第三军医大学西南医院 风湿免疫科 方勇飞. 类风湿关节炎. 难治性自身免疫性疾病

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方勇飞简介 主任医师、教授、 博士研究生导师 第三军医大学西南医院

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  1. 方勇飞简介 主任医师、教授、 博士研究生导师 第三军医大学西南医院 中西医结合科与风湿病专科主任 学术任职： 中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员 中华中医药学会风湿病分会常务委员 中华医学会风湿病分会委员 中国医师协会风湿免疫科分会常务委员 重庆市医学会风湿病专业委员会主任委员

  2. 盐酸青藤碱（正清风痛宁）的作用机理及临床应用盐酸青藤碱（正清风痛宁）的作用机理及临床应用 第三军医大学西南医院 风湿免疫科 方勇飞

  3. 类风湿关节炎 • 难治性自身免疫性疾病 • 慢性炎症，关节破坏性疾病；免疫、关节退化性系统障碍 • 病因复杂，没有理想的治疗方法，没有有效的药物，需要长期治疗

  4. 动物模型： 关节炎评分 足爪体积 活性 & 增殖 关节炎 T –淋巴细胞 促炎细胞因子的分泌 关节滑膜炎 关节疼痛 滑膜增生 巨噬细胞 功能丧失 软骨和骨破坏 成纤维细胞 IL-1 TNF- IL-6 僵硬 MMPs和TIMPs之间的失衡 • 类风湿关节炎的发病机制 炎症介质的生产 MMPs: matrix metalloproteinases TIMPs: tissue inhibitor of metalloproteinases

  5. 市场上治疗风湿病的中药 • 盐酸青藤碱—正清风痛宁针剂和片剂 • 白芍总苷胶囊 • 雷公藤制剂 • 乌头提取物 • 昆虫提取物

  6. 青藤碱的原药材—青风藤 Plant Crude drug Sinomenium acutum, (family Menispermaceae) Caulis Sinomenii 青風藤 Qingfengteng

  7. 青藤碱的特性 • 从青风藤茎中提取的生物碱 • 用于治疗类风湿关节炎的免疫抑制剂 青藤碱

  8. 第一部分 青藤碱的抗关节炎药理作用及机理 Liu L. Int. J. lmmunopharmac., Vol. 18, No. 10, pp. 529 543, 1996

  9. 在组织和器官中的毒理学分布 药品使用 -给予大鼠腹腔注射150mg／kg青藤碱连续6周后，与药物混悬液1周之前检查 在血液和器官中的药物浓度排序 肝脏>心脏>肾>血>肺>脑（6WS） 睾丸和脾中没监测到（6WS） 肝脏和肾脏的损害 SDH和LDH酶不影响肝细胞水肿变化 肾脏组织无变化 精子活力的损害 精子活性减弱，但是停药后消失 精子活性无明显改变(6Ws+1W) 10

  10. 抗炎镇痛 霍海如，等, 西安交通大学学报(医学版), 1989(4): 第346-349页. 11

  11. 减轻炎性痛及神经痛 In normal rats and mice, systemic sinomenine produced moderate antinociceptive effect in the hot plate and tail flick tests. Sinomenine also exerted analgesic effects on mechanical and heat hypersensitivity in mice after carrageenan induced inflammation. sinomenine effectively alleviated mechanical and cold allodynia in rats and mice after injury to peripheral nerve or spinal cord. The analgesic effect of sinomenine is not associated with side effects and is not reversed by the opioid receptor antagonist naloxone. Gao T, etEur J Pharmacol. 2013 Dec 5;721(1-3):5-11 12

  12. 减轻炎性痛及神经痛 Gao T, etEur J Pharmacol. 2013 Dec 5;721(1-3):5-11 13

  13. 对佐剂性关节炎（AA)的影响 • 方法： • 皮下注射0.1ml的液体，500ug，已经在石蜡中消毒 • 注射盐酸青藤碱至36天，15、50、150mg／kg的不同剂量组，分别称重 • 结果： • 显著改善的临床参数包括：关节炎评分，后爪体积，血沉，体重增加。

  14. arthritis score Treatment Time(days) 盐酸青藤碱对佐剂性关节炎大鼠关节评分的影响 ▓: vehicle, n=9 ▲: sinomenie(150mg/kg), n=8 △: sinomenine(50mg/kg), n=9 □: sinomenine (15mg/kg), n=9 Data are means SE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AA rats. .

  15. 1.3 1.2 1.1 1.0 Hind paw volume(ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 10 20 30 40 0 Treatment Time (days) 盐酸青藤碱对佐剂性关节炎大鼠后爪体积的影响 ▓: vehicle, n=9 ▲: sinomenie(150mg/kg), n=8 △: sinomenine(50mg/kg), n=9 □: sinomenine (15mg/kg), n=9 Data are means SE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AA rats.

  16. 190 180 body weight (g) 170 160 150 0 10 20 30 40 Treatment Time(days) 盐酸青藤碱对佐剂性关节炎大鼠体重的影响 ▓: vehicle, n=9 ▲: sinomenie(150mg/kg), n=8 △: sinomenine(50mg/kg), n=9 □: sinomenine (15mg/kg), n=9 Data are means SE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AA rats.

  17. 20 15 ESR (mm/h) 10 5 ** ** ** 0 0 10 20 30 40 Treatment Time (days) 盐酸青藤碱对佐剂性关节炎大鼠血沉的影响 ▓: vehicle, n=9 ▲: sinomenine (150mg/kg), n=8 △: sinomenine (50mg/kg), n=9 □: sinomenine (15mg/kg), n=9 Data are means SE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AA rats.

  18. 对抗原诱导性关节炎（AIA)的影响 方法： 免疫 • 分别在21天和14天,大鼠皮下注射日总体积的悬浮液含有等量的磷酸盐0.2ml 0.5mg/ml mBSA • 缓冲盐水（PBS）和弗氏完全佐剂（2mgMT/毫升） 关节炎的诱发 • 免疫初期，在右膝关节腔中注射0.1ml 甲基化小牛血清蛋白 关节炎的复发 • 42天的时候，在右膝关节腔中注射0.1mg 在缓冲液中的mbsa

  19. 对抗原诱导性关节炎(AIA)的影响 • 治疗： • 1-6天的短期治疗中，1、15、50mg／kg的不同计量组，分别称重 • 1-14天的中期治疗中，1、15、50mg／kg的不同剂量组，分别称重 • 8-41天的长期治疗中，1、15、50、150mg/kg的不同剂量组，分别称重

  20. ■: vehicle； ▲: sinomenine(150mg/kg) Swelling(mm) Treatment Time (days) 盐酸青藤碱的短期治疗中对急性抗原诱导性关节炎肿胀的影响 ▓: vehicle, n=6 ▲: sinomenie(150mg/kg) , n=6 Data are meansSE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AIA rats.

  21. 4 Sinomenine (150mg/ml) vehicle 3 2 histologicalscore * 1 0 inflammatory infiltration bone formation joint destruction fibrosis 盐酸青藤碱短期治疗中对急性抗原诱导性关节炎组织学评分的影响

  22. 3 2 swelling (mm) 1 0 -1 4 9 14 19 24 Treatment time (days) 盐酸青藤碱中期治疗大鼠急性抗原诱导性关节炎的影响 ▓: vehicle, n=5 ▲: sinomenine(150m/kg), n=5 △: sinomenine (50mg/kg), n=5 □: sinomenine (15mg), n=9 ○: sinomenine (1mg/kg), n=5. Data are means SE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AA rats.

  23. 10 8 6 ESR (mm/h) * 4 * 2 0 8 2 time (days) 盐酸青藤碱的中期治疗中对大鼠急性抗原诱导性关节炎血沉的影响 ▓:vehicle, n=5 ▲ : sinomenine(150m/kg), n=5 △: sinomenine (50mg/kg), n=5 □ : sinomenine (15mg), n=9 ○: sinomenine (1mg/kg), n=5. Data are means SE, *p<0.05, **p<0.01 in comparison to vehicle-treated AA rats.

  24. Prepare rats and load CII/IFA into a syringe Intradermally injection of collagen II on day 0 and 7 Arthritic signs appeared around day 10-15 对II型胶原型关节炎(CIA)的影响 Prepare CII/IFA emulsion

  25. 用青藤碱治疗，能抑制发病率（a）,关节炎评分（b），后爪体积（c），血沉（d）。每天处理大鼠腹腔内注25，50或100毫克/公斤青藤或载入或口服剂量为1毫克/千克吲哚美辛，从第0天开始，直到第30天，免疫CII/ IFA。 * P<0.05，** P <0.01与载入处理的大鼠组比较（n =10）

  26. 青藤碱抑制淋巴细胞增殖作用 [3H]-thymidine incorporation (% of control) Sinomenine(g/ml) 青藤碱对人PBMC增殖的抑制作用 □Con A ( 2 days incubation, half-maximal inhibition 400  M) ▓ MLC (5 days incubation, half-maximal inhibition 60  M)

  27. 100 80 60 [3H]-thymidine incorporation (% of control) 40 20 0 100 0.1 1 10 1000 sinomenine(g/ml) 抑制脾细胞的增殖 ○PHA（5天孵化，半抑制为34M） △ TPA+离子霉素（5天孵化，半抑制129M） ● MLC（5天孵化，半抑制100M）

  28. 青藤碱抑制抗原诱导性关节炎大鼠中成纤维细胞的增殖青藤碱抑制抗原诱导性关节炎大鼠中成纤维细胞的增殖 100 80 [3H]-thymidine incorporation (% of control) 60 40 20 0 1000 10 100 Sinomenine (g/ml) 抑制抗原诱导性关节炎大鼠中成纤维细胞的增殖 ■: witjhout stimulation , △ : with 2ng/ml TGF-2 ○ :with 100U/ml IL-1

  29. 3 2 [3H]-thymidine incorporation (cpm 1000) 1 *** *** *** *** *** *** *** 0 C1 C2 0 0.5 1 0.2 4 8 24 48 Time (h) following addition of TGF-2 1mm的盐酸青藤碱作用于滑膜成纤维细胞的抗增殖作用（细胞培养3天）的时间过程 C1: control incubation without TGF-2C2：TGF-2 (20ng/ml) The rests: Sinomenine (1mM)+TGF- 2 ***p<0.005 in comparison to C2 .

  30. 抑制巨噬细胞活性和炎症导致的增殖 小鼠腹腔巨噬细胞合成PGE2和LTC4： • 刺激：两种物质分别刺激2h，1h • 刺激前，用青藤碱预处理一个小时 • 细胞时间：2h 巨噬细胞产生一氧化氮 • 刺激：lps＋inf－r • 细胞时间：24h

  31. 100 100 80 80 60 60 LTC4 (% of control) PGE2 (% of control) 40 40 20 20 0 0 0.1 1 10 0.1 1 10 Sinomenine( mM) Sinomenine( mM) 盐酸青藤碱对小鼠巨噬细胞合成PGE2和LTC4的影响，用zymosan50ug/ml刺激

  32. 100 80 60 Nitric oxide production ( % of control) 40 20 0 0.01 0.1 1 Sinomenine (mM) 抑制细胞产生一氧化氮

  33. 对致炎性细胞因子合成和基因表达的影响 人外周血单核细胞 • 抑制IL－1, TNF-, IL-6 • 半抑制浓度在0.5mM出现 Cytokines concentration(% of control) Sinomenine concentrations(mM) 青藤碱对人体外周血单核细胞的细胞因子的合成 ▓ : IL-1，● : TNF▲ : IL-6

  34. 青藤碱对巨噬细胞系统的影响 TNF- 3500 3000 29% 2500 49% 2000 TNF- concentration (pg/ml) 1500 1000 93% 500 0 LPS L+Sin1 L+Sin2 L+Sin3 青藤碱对巨噬细胞TNF－α介导的蛋白质合成的影响 Inhibitory rate: Sin1(1mM):93.46%; Sin2(0.5mM)49.46%; Sin3(62.5M)29.01%. LPS: 5g/ml Incubation time: 24h

  35. 抑制巨噬细胞的环氧化酶生成 COX-1 COX-2 ▲: sinomenie ▓: indomethacin Fig.25 Effect of sinomenine on COX-1 and COX-2 enzymatic activity in vitro

  36. 青藤碱抑制滑膜细胞的增殖 • 抗增殖 青藤碱通过诱导Hs701.T细胞发挥对IL-1β的抗增殖作用。细胞接种于密度为2.5×10个细胞/ ml的96 - 孔板中，并补充10％FBS的DMEM培养液，孵育24小时，然后附加在无血清培养基中，培养72小时。然后将细胞共培养于10ng/ml的IL-1β和不同浓度的青藤碱（0.125-1mm）。一个优越条件细胞培养实验，在10um的右美托咪定中。用 3H-胸苷掺入法测定青藤碱的抗增殖作用

  37. 细胞周期试验 G1: 64.84% G2: 22.45% S: 12.71% G1: 87.80% G2: 9.04% S: 3.16% G1: 88.59% G2: 7.37% S: 4.04% G1: 89.59% G2: 8.32% S: 2.09% G1: 89.55% G2: 4.70% S: 5.75% G1: 83.69% G2: 7.93%, S: 8.39% 0 hr 24 hr 48 hr 72 hr 96hr Starvation 72hr+IL-1 24h Cell cycle progression test of Hs701.T cells for determination of genes expression. Cells were seeded in 6-well plate until confluence and incubated in a serum free DMEM at different time intervals for starvation. The proportion of DNA in G1, S and G2/M phase was determined by flow cytometry. In (A) 1 to 5 represented the cells were subjected to starvation for 0, 24, 48, 72 and 96 hr respectively. In (B), cells were starved for 72 hrs and sequentially incubated with IL-1 for 24 hrs.

  38. 青藤碱可抑制人滑膜细胞的IL－1β的表达，从而调节基因表达，抑制信号转导，细胞的粘附和相关蛋白的基因青藤碱可抑制人滑膜细胞的IL－1β的表达，从而调节基因表达，抑制信号转导，细胞的粘附和相关蛋白的基因 • 磷脂酰肌醇4激酶催化，α多肽 • 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白），α刺激活性多肽1 • Ras相关C3肉毒杆菌毒素基板2（Rho家族小GTP结合蛋白RAC2） • Janus激酶3（一种蛋白质酪氨酸激酶，白细胞） • 前列腺素E受体3（EP3亚型） • 神经颗粒素（蛋白激酶C基板，RC3） • 骨形态发生蛋白1 • 内皮细胞分化，溶血磷脂酸的G-蛋白偶联受体，4 • trophinin相关蛋白（tastin）

  39. 抑制炎症基因 • trophinin相关蛋白（tastin） • 抑瘤素M • 白细胞介素-6（干扰素，β2） • 白细胞介素13 • 神经酪氨酸激酶，受体，3型 • 丝裂原活化蛋白激酶1 抑制细胞的增殖，分化，生长和转化的基因和细胞周期控制 • CCAAT/增强子结合蛋白（C/ EBP），α • B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤3 • PCTAIRE蛋白激酶3 • 转化生长因子，α • 丁酸响应因子（EGF反应因子1） • 泛素结合酶E2A（RAD6同源） • 染色质的解旋酶的DNA结合蛋白3 • 神经营养因子-3

  40. 抑制血管生成，组织和微血管重塑和肝细胞生长因子激活抑制血管生成，组织和微血管重塑和肝细胞生长因子激活 • Janus激酶3（一种蛋白质酪氨酸激酶，白细胞） • 胶原蛋白，VI型，α2 • 胶原蛋白I型，α2 • 透明质酸结合蛋白2 • 胎盘生长因子，血管内皮生长因子相关蛋白 • 内皮素2 • 神经颗粒素（蛋白激酶C基板，RC3）

  41. 促进肿瘤细胞凋亡,增强化疗药物对肿瘤治疗的敏感性,与化疗药有协同增效作用促进肿瘤细胞凋亡,增强化疗药物对肿瘤治疗的敏感性,与化疗药有协同增效作用 Activation of PI3K/Akt and ERK signaling pathways antagonized sinomenine-induced lung cancer cell apoptosis. Sinomenine reverses multidrug resistance in bladder cancer cells via P-glycoprotein-dependent and independent manners. Cooperative inhibitory effect of sinomenine combined with 5-fluorouracil on esophageal carcinoma. Sinomenine sensitizes gastric cancer cells to 5-fluorouracil in vitro and in vivo. 1, Chen Y,et al. Pharmazie. 2014, 69(1):48-54. 2 ,Wang J,et al. World J Gastroenterol. 2013,19(45):8292-300. 3, Lian F et al. Oncol Lett. 2013, 6(6):1604-1610. 42

  42. 作用机理（RA患者） • 调节Th1/Th2亚群间网络失衡，抑制RA患者分泌IFN-γ水平，上调IL-4的表达 • 抑制RA患者树突状细胞中TLR2和TLR4表达，从而抑制TLR介导的炎症信号转导 • 抑制趋化因子对RA患者树突状细胞的趋化作用，减少其趋化因子的分泌 • 抑制树突状细胞转录因子-κB活性，阻断其分化成熟，阻止了它在类风湿关节炎发病中的抗原提呈作用 • 抑制树突状细胞CD80 mRNA 、CD86 mRNA 的表达, 阻断对其T细胞的协同刺激

  43. 作用机理（RA患者） • 抑制树突状细胞IL-12的分泌及其表面分子CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达，从而抑制树突状细胞激活T细胞的能力 • 下调bcl-2蛋白表达及阻滞G1期细胞向S期移行，诱导RA患者滑膜细胞凋亡 • 抑制RA患者成纤维样滑膜细胞的增殖，并下调MMP-3的表达 • 抑制RA患者成纤维样滑膜细胞的增殖，诱导其凋亡

  44. 作用机理（细胞实验） • 抑制T淋巴细胞活化和增殖, 将细胞阻断于G0 /G1期, 其作用可能与下调T细胞转铁蛋白受体的表达, 减少细胞对铁离子摄入有关 • 通过影响钙离子依赖的T细胞活化信号传导途径抑制T细胞活化异常 • 抑制单核细胞的增殖，促进其凋亡 • 提高巨噬细胞吞噬能力,减少炎症因子TNF-α、IL-6mRNA和蛋白表达 • 抑制巨噬细胞NF-κB p65 核移位和IκB-α降解有关

  45. 作用机理（细胞实验） • 下调人外周血单个核细胞IL-1β、IL-8mRNA • 抑制人外周血单核细胞COX、IL-1β、TNF-α基因表达 • 选择性抑制COX-2的活性 • 抑制DC的发育成熟和免疫应答功能 • 抑制TNF-α诱导的脐静脉内皮细胞VCAM-1的表达、抗血管平滑肌细胞增殖 • 抑制肥大细胞增殖，能促进肥大细胞凋亡，抑制肥大细胞活化脱颗粒 • 抑制补体激活的中性粒细胞的溶酶体酶释放

  46. 第二部分 我科关于青藤碱的部分机制研究 47

  47. 光镜下RA滑膜细胞凋亡形态 加药后部分细胞由贴壁脱落而呈悬浮生长，贴壁能力减弱，细胞形态变圆，体积缩小，核固缩出现。3.2mmol/LSN作用48h组尤为明显。不含药培养液培养的对照组细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片 RA滑膜细胞光镜下的结构　×403.2mmol/LSN作用滑膜细胞48h×40

  48. 荧光显微镜下RA滑膜细胞凋亡形态 荧光显微镜下见正常对照组细胞核较大，呈均匀弥散荧光；处理组细胞出现典型的凋 亡核形态学改变，表现为核体积缩小，大小不一，染色不均匀，呈致密浓染的颗粒或 块状增强荧光 正常滑膜细胞核 　　　（×200） 青藤碱终浓度2.8mmol/L（×200） 12小时 24小时 48小时

  49. 青藤碱终浓度3.0mmol/L（×200） 12小时 24小时 48小时 青藤碱终浓度3.2mmol/L（×200） 12小时 24小时 48小时

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