质粒分子生物学与质粒技术

1. 质粒分子生物学与质粒技术

2. 第1讲 质粒分子生物学概论 • 什么是质粒 • 质粒的复制分配和不相容性 • 质粒的接合转移 • 细菌质粒控制的表型 ①抗性质粒 ②毒力质粒 ③降解质粒 ④共生质粒

3. 1 什么是质粒 1.1 定义和命名 质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的，符合这三条标准的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。狭义的质粒一般是指细菌染色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小写字母 p 加 2-3 个大写字母和数字，如 pJP4，pDTG1。

4. 1.2 细菌质粒 　　细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子 (cccDNA)，其大小在1-1700 kb之间。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生质粒等类型。

5. 1.3 真核生物的DNA质粒 • 环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线立体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。 • 线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。

6. 1.4 真核生物的RNA质粒 • 有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性． • 无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒。

7. 2 质粒的复制、分配和不相容性 2.1 复制 (Replication) 质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。

8. 2.3 不相容性 (Incompatibility) 两种质粒不能在同—个寄主细胞中共存的现象，叫质粒的不相容性。质粒之间的不相容性，是由于它们存在—种或几种与质粒复制或分配有关的相同因子，如基本复制子中的反向转录区(ColE1质粒的RNAⅠ)，ori区中的重复子(Iteron)，与分配蛋白结合的分配位点。不相容性是质粒分类的理想标准。肠道细菌质粒分别属于30多个不相容组，用Inc表示。

9. 3质粒的接合转移 通过细胞与细胞之间的接触，使DNA从一个细胞转移到另外一个细胞的现象叫接合(Conjugation)。这一过程由接合性质粒的转移 (tra) 基因区编码。被转移的DNA可以是接合质粒本身，也可以是染色体或可诱动的非接合性质粒。得到供体DNA的受体细胞称为接合体或接合子。每个供体细胞所产生的接合体数称为接合频率。

10. 3.1 F质粒的接合转移机制 F质粒的分子大小为100 kb，编码接合转移功能的tra基因区位于遗传和物理图谱的66.6－100 kb 位置，编码37个蛋白质和1个反义RNA，这些分子分别负责性菌毛的合成和装配，杂交对的稳定，表面排斥，DNA转移，以及tra区基因表达的调节。

11. 图1-10 F质粒接合转移区的结构（66.6-100 kb区） traA：性菌毛亚基； traN和traG：杂交对稳定； traS和traT：表面排斥； traM：转移信号； traY：缺口酶； traI：DNA解旋酶； traD：驱动单链DNA转移；traJ、finO、finP：调节基因

12. 3.2 细菌染色体的诱动 细菌的染色体与质粒的转移原点oriT序列共价连接，染色体作为质粒DNA的延伸部分被转移。可以利用这一功能定位染色体基因，以及获得含有染色体片段的质粒。

13. 3.3 非接合质粒的诱动 许多天然质粒虽然是非接合性的，但仍然含有一个oriT位点和转移基因，当与它共存的接合质粒提供一个接合系统时，也能进行有效的转移，称之为诱动 (Mobilization)。

14. 4 细菌质粒控制的表型 4.1 抗性质粒 包括抗菌素抗性（R）质粒和金属抗性质粒。R质粒的进化、转移和扩散给抗菌素治疗带来很大麻烦，是医学所面临的重大问题之一。R质粒与转座子（Transposon）和整合子（Integron）的相互作用，使细菌耐药性问题更加严重。

15. 4.2 毒力质粒 许多细菌的致病力和毒性与质粒有关，如大肠杆菌肠毒素和定居抗原，破伤风毒素，炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，植物冠瘿病（Ti质粒）和发根病（Ri质粒）。

17. 4.3 降解质粒 许多环境污染物的降解途径由质粒基因编码，降解基因组成几个操纵子，操纵子的表达受调节基因控制。目前，已经测定全序列并注释基因的降解质粒有10余种，分别是尼龙寡聚体降解质粒pOAD2，芳香烃降解质粒pNL1，除草剂阿特拉津降解质粒pADP-1，甲苯降解质粒pWWO，烟碱降解质粒pAO1，咔唑降解质粒pCAR1, 异丙基苯降解质粒pBD2，卤乙酸降解质粒pUO1，2,4-D降解质粒pJP4，萘降解质粒pND6-1和pDTG1。

18. The catabolic plasmids that complete sequence has been determinedPlasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic References genespOAD2 Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA Microbiology oligomers nylBC 1995,141:2585pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, J. Bacteriol.m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch 1999,181:1585pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108845 atzA,atzB J. Bacteriol.atzC,atzDEF 2001,183:5684pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl Envi.. Microbiol. 2002,4:856pAO1 Nicotine Arthrobacter 165137 ndh, 6hlno J. Bacteriol.nicotinovoranskdh, dhph 2003,185:1976pCAR1 Carbazole P. resinovorans CA10 199035 carABCDEF J. Mol. Biol.antABC 2003,326:21pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus 210205 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. Erythropolis BD2 2003,185:5269pUO1 Haloacetates Delfitia 67066 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. Acidovorans B 2003,185:6741pJP4 2,4-D Ralstonia 87688 tfdA, tfdB Envi..Microbiol. 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 tfdCDEF 2004,6:655pND6-1 naphthalene Pseudomonas ND6 101858 nah Gene 2004,336:231pDTG1 naphthalene P. putida 83042 nah J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2004,341:753

19. 4.4 共生质粒 在许多根瘤菌属细菌中存在与结瘤和固氮有关的共生质粒，质粒的大小在1000 kb以上，与细菌染色体基因一起行使固氮功能。Sinorhizobium meliloti 的豆科共生复合基因组由3部分组成：染色体为3654135 bp，pSymA为1354226 bp（结瘤和固氮），pSymB为1683333 bp。

20. 中华苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）1021的基因组组成 性质 染色体 pSymA pSymB 基因组 长度(bp) 3654135 1354226 1683333 6691694 蛋白基因 3341 1293 1570 6204 tRNA基因 51 2 1 54 rRNA操纵子 3 0 0 3 共生功能 菌毛合成 菌毛合成 表面多糖 结瘤，固氮 表面多糖 固氮

21. 第2讲 质粒技术1. 质粒的分离和纯化2. 质粒的拷贝数测定3. 质粒DNA转化4. 细菌杂交实验5. 质粒的限制酶作图6. 质粒基因定位7. 质粒测序和基因注释8. 质粒克隆载体

22. 1 质粒的分离和纯化 分离： SDS温和裂解法；碱—SDS室温裂解法；碱—SDS加热 (50—65℃) 裂解法；煮沸裂解法；碱—SDS—蛋白酶裂解法。 纯化: CsCl—EB密度梯度离心法 (角转头：40000rpm, 40h；近垂直转头：78000rpm, 4.5h)；低熔点琼脂糖凝胶回收法；凝胶冻溶法；凝胶透析袋回收法；凝胶透析膜回收法；纯化kit。

23. 2 质粒的拷贝数测定（凝胶带荧光光密度测定法） • 细胞裂解物进行琼脂糖凝胶电泳，荧光扫描染色体DNA带和质粒DNA带，根据峰面积计算质粒占总DNA的百分数(RP)。 RP = (1.36×质粒峰面积)÷(染色体峰面积+1.36×质粒峰面积) • 测定一个细胞中总DNA的含量 (Mc = DNA的g数／细胞数)。 • 计算一个质粒的质量： MP = 质粒 bp 数×660×1.65×10-24 g • 计算质粒拷贝数：CP = (MC×RP)÷MP

24. 3 质粒DNA转化 质粒转化主要有3种方法：钙诱导的感受态转化，原生质体转化，电穿孔转化。影响转化的因素：质粒的大小、纯度、浓度、构型、稳定性和是否被修饰；受体细胞的菌龄、用量、限制-修饰系统和重组功能，是否有不相容性质粒，与质粒原来寄主的亲源关系；筛选药物的浓度。 转化频率（transformation frequency）：每个活细胞产生的转化子数，测定时使用饱和DNA浓度。 转化效率（transformation efficiency）：每 mg DNA产生的转化子数，测定时使用亚饱和DNA浓度。

25. 4 细菌杂交实验 • 滤膜杂交：混合供体和受体菌培养物，用孔径为0.45mm的滤膜过滤，带菌的滤膜在营养平板上培养过夜，用无菌水洗下膜上的细菌，涂选择平板，筛选接合体。 • 平板杂交：在选择平板上涂布供体菌和受体菌的混合物或分别划线受体菌和供体菌，培养过夜，长出的菌落为接合体。 • 液体杂交：静止培养供体菌和受体菌的混合物，然后涂选择平板，筛选接合体。 例：PpG378 (Leu-Nah+) × PpG376 (Leu+Nah-)

26. 5 质粒的限制酶作图 制作质粒限制图的方法主要有直接酶切法、重叠片段克隆法和测序法。直接酶切法是通过限制酶的完全消化和部分消化，确定各种限制酶切割位点在质粒中的位置，适用于小质粒；重叠片段克隆法是先进行限制片段的克隆，确定每个克隆片段的限制酶位点，以及各克隆片段在质粒中的排列顺序，最后得到整个质粒的限制图，适合于较大的质粒。最理想的方法是先测定质粒的核苷酸序列，然后根据限制酶的识别序列用计算机作图，适合于所有质粒，特别是巨型质粒。

27. ② pND1.860质粒的限制酶作图 （重叠片段克隆法） 作图策略： • HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ单酶消化：测定限制片段大小和切点数。 • HindⅢ完全消化→片段克隆→HindⅢ + EcoRⅠ消化：确定HindⅢ片段中的EcoRⅠ位点 • HindⅢ部分消化→片段克隆： HindⅢ消化，确定HindⅢ片段排列顺序 EcoRⅠ消化，确定EcoRⅠ位点 EcoRⅠ+ XbaⅠ消化，确定XbaⅠ位点

28. 6 质粒基因定位：转座子插入突变法 把携带转座子的质粒引入含有待测质粒的细胞中，筛选并收集含有插入突变的细胞，通过限制酶分析确定插入位点，然后测定含有转座子插入的细胞其待测基因是否失活，从而确定基因的大概位置。

29. 图2-10 阿特拉津氯水解酶基因atzA的定位

30. 7 质粒测序和基因注释(annotation) 质粒测序：用鸟枪克隆法，将纯化的质粒用超声波打碎，用琼脂糖凝胶电泳分离 1-２kb片段，补平片段末端，与平末端pUC18连接，电转化 E. coli DH5α，筛选有插入片段的转化子，测定克隆片段的序列，根据测序结果拼接质粒序列，空缺部分用PCR方法补齐并测序。 质粒基因注释：向GenBank注册质粒序列，报告每个编码序列（CDS，或称ORF）的基因名称、位置、功能和翻译产物。

31. 哺乳动物细胞表达载体 载体的类型： ① 自主复制的瞬时表达载体：带有真核病毒复制子。 ② 与寄主基因组整合的表达载体：不含病毒复制子。

32. 哺乳动物细胞表达载体的功能元件： ① 原核细胞复制原点和筛选基因 (抗生素抗性)。 ② 真核启动子和增强子元件。 ③ 能进行染色体外复制的病毒复制子序列。 ④ 在哺乳动物细胞中表达的选择标记基因 (抗生素或药物抗性)。 ⑤ 终止和加poly(A)的信号序列。 ⑥ 带有剪接供体和剪接受体功能位点的内含子序列 (用于mRNA剪接) ⑦ 多克隆位点。

33. 哺乳动物细胞表达载体对克隆基因的要求： ① 一般使用cDNA。 ② 克隆基因必须带有天然的 rbs 和单一的起始密码子AUG。

34. 图2-21 瞬时表达载体pMSG

35. 图2-22 制备等基因表达的 Flp-InTM寄主细胞系 (invitrogen 公司)

36. 图2-23 制备 Flp-InTM表达细胞系 (invitrogen 公司)