Nicolas Bertrand & Myriam Baratin

1. De la culture cellulaire à l’expression de protéines impliquées dans la réorganisation du cytosquelette TD1 Initiation à la culture cellulaire TD2 Les différentes méthodes de transfection cellulaire Les petites protéines G de la famille Rho TD3 Description desprotocoles Nicolas Bertrand & Myriam Baratin

2. Initiation à la culture cellulaire Culture primaire/secondaire Les milieux de culture/maintien des lignées Les paramètres physico-chimiques Matériel et instruments La congélation Les contaminations

3. 1- culture primaire/secondaire Culture primaire C'est une culture de cellules qui proviennent directement d'un tissu. Cette première culture pourra, par la suite, donner lieu à des cultures dites "secondaires«  Traumatisme Contamination Culture secondaire Des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). Ce sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

4. Transformation cellulaire: acquisition de caractères propres à la cellule maligne • Autonomie de croissance • Perte de l’inhibition de contact • Immortalité • Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance et des interactions avec la MEC • Tumorigénicité chez la souris nude

5. Immortalisation cellulaire Cellules tumorales Hela: carcinome Raji: lymphome de Burkitt Cellules post-crise Immortalisation spontanée (fibroblastes murins) Cellules immortalisées par l’expérimentateur (expression d’oncogènes viraux, de la télomérase)

6. How can cells be made immortal?Several methods exist for immortalizing mammalian cells in culture. Viral genes, including Epstein-Barr virus (EBV), Simian virus 40 (SV40) T antigen, adenovirus E1A and E1B, and human papillomavirus (HPV) E6 and E7 can induce immortalization by a process known as viral transformation. Although the process is reliable and relatively simple, these cells may become genetically unstable (aneuploid) and lose the properties of primary cells. For the most part, these viral genes achieve immortalization by inactivating the tumor suppressor genes that put cells into a replicative senescent state. The preferred method to immortalize cells is through expression of the telomerase reverse transcriptase protein (TERT), particularly those cells most affected by telomere length (e.g., human). This protein is inactive in most somatic cells, but when hTERT is exogenously expressed the cells are able to maintain telomere lengths sufficient to avoid replicative senescence. Analysis of several telomerase-immortalized cell lines has verified that the cells maintain a stable genotype and retain critical phenotypic markers.

8. Deux sources de cellules sont possibles : 1 - Les cellules circulantes (en suspension ) sang moelle osseuse liquides physiologiques 2- Cas des cellules à partir de tissus ou d'organes (adhérentes)

11. American Type Culture Collection (ATCC) a nonprofit organization in Rockville, Maryland The ATCC Cell Biology Collection is the most comprehensive and diverse of its kind in the world, consisting of over 3,400 cell lines from over 80 different species. It holds over 950 cancer cell lines, 1,000 hybridomas and several special collections including stem cells.

12. Pourquoi mettre des cellules en culture? • Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire Conservation des caractéristiques du tissu initial • Accessibilité • Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués • Homogénéité des cellules • Matériel en grande quantité

13. Cycle de croissance d'une lignée cellulaire en culture in vitro Immortalisation cellulaire: Acquisition de la capacité à se multiplier indéfiniment

14. Culture continue Phase stationnaire Phase de latence Phase exponentielle Nombre de cellules Mort cellulaire Temps (jours) Phase de latence pas de division cellulaire dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire Phase exponentielle Phase de division cellulaire Temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h) Phase stationnaire Epuisement du milieu = arrêt de la prolifération Poursuite de la croissance cellulaire (repiquage) ou mort cellulaire

16. Cellules de mammifères A priori, se rapprocher le plus possible des conditions du milieu intérieur

17. Reproduction et maintien d’un environnement physiologique Paramètres physiologiques Température37°C, permissivité faible Ions inorganiques aspect qualitatif et osmolarité pO2 et pCO2 pH 7.2-7.5  Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%) CO2 + H2O HCO3- + H+ Indicateur coloré: Rouge de Phénol Hygrométrie85% (évaporation) Lumière visible à éviter

18. Fourniture d’aliments essentiels Métabolisme énergétique Biosynthèse Catalyse enzymatique (vitamines, oligoéléments) Surface de culture Cas des cellules adhérentes avec dépendance à l’ancrage

19. Mise à disposition de molécules de transport Pour Hormones Oligoéléments Lipides Mise à disposition de facteurs d’adhérence En fonction de la capacité des cellules utilisées à produire ces facteurs en plus ou moins grande quantité Mise à disposition de molécules informatives Hormones Facteurs de croissance

20. Reproduire l’environnement physiologique a . a. e s sen ti e ls a . a. syn t hé tis és pa r de s a . a. syn t hé tis és pa r l e s be s o i n en a. a . pour l es ce ll u l e s s péc i a li s é es dans ce ll u l e s dan s l 'o r gan i s me e t ce ll u l e s dan s l 'o r gan i s me e t l 'o r gan i s m e donc à r a j ou t e r en cu lt ur e en cu lt ur e en cu lt ur e a r g i n i ne g l u t a mi ne g l yc i ne i so l eu ci ne t y r os i ne s e r i ne h i s ti d i ne cy st é i ne a l an i ne l euc i ne a s par a g i ne l ys i ne ac i de a s par ti que m é t h i on i ne ac i de g l u t a mi que phény l a l an i ne p r o l in e t h r éon i ne tr yptoph a ne va li ne • Les milieux • La base: milieu synthétique • - acides aminés • - sels minéraux • - NRJ (glucose/glutamine) • - Vitamines (fragiles, ne pas autoclaver) • Les Suppléments • Indéfini: sérum (albumine/transferrine/hormones) • extrait de tissus • milieu conditionné • Défini: Facteurs de croissance • Les antibiotiques • - Éliminer complètement le contaminant microbien • - Ne pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules • - Compatible avec les autres éléments du milieu • - Large spectre d’action

21. Dulbecco'sModifiedEagle Medium (D-MEM) (1X) liquid (high glucose)Contains 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine and 25 mM HEPES buffer but no sodium pyruvate or phenolred.

23. Technical Resources - Media Formulations Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (1X) liquid Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a defined media formulation designed to reduce significantly the amount of serum required for cultivating mammalian cell in vitro. This enhanced standard basal formulation allows for a 50 - 80% reduction in the required serum supplementation with no cell adaptation needed. Suitable for the growth of maintenance of a variety of common cell lines including MDBK Hep-2 COS-7 A549 MDCK WI-38 and others this medium supports cell growth and morpholigical characteristics of both adherent and non-adherent cell lines. It is formulated without L-glutamine for increased stability. Supplementation with L-glutamine is required. Recommended concentration of serum is 1 - 5%; the concentration must be adjusted for each individual cell line to achieve optimal results.

26. Each Advanced™ medium is the standard published basal formulation, supplementedwith NEAA and sodium pyruvate.  We’vealsoaddedtheseingredients to allowserumreduction:

27. Contaminations Contaminants biologiques Bactéries Levures/moisissures Virus Mycoplasmes Contaminants chimiques Endotoxines Qualité du plastique Reste de détergent Trace d’aluminium Résidus désinfectants Contamination croisée Autres cellules

28. Mycoplasme Micro-organisme procaryote de type bactérien, dépourvu de paroi rigide (possédant une simple membrane) et capable de multiplication autonome.

29. Un antibiotique[1] (du grecanti : « contre », et bios : « la vie ») est une substance qui a une action spécifique de bloquage ou même de destruction des bactéries. Pour les autres micro-organismes, on utilise le terme d'« antifongique » s'il s'agit de lutte contre les champignons, ou d'« antiviral » s'il s'agit de lutte contre les virus. Cette substance peut avoir une action toxique directe, c'est-à-dire bactéricide ; son efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des micro-organismes (action bactériostatique).

30. Beta-lactamine Beta-lactamine Aminoside Antibiotiques doivent: Eliminer complètement le contaminant microbien Ne doivent pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules Compatible avec les autres éléments du milieu Large spectre d’action

31. Les pénicillines sont des antibiotiques bêta-lactamines. À la base, la pénicilline est une toxine qui provient de la moisissure penicillium provenant du champignon Penicillium notatum et qui est inoffensive pour l'homme. Les pénicillines ont pour formule chimique : R-C9H11N2O4S où R est une chaîne variable. Les pénicillines A sont des aminopénicilline à spectre élargi. L'ampicilline et surtout l'amoxicilline sont ses deux principaux représentants. Pénicilline G Les pénicillines et les autres antibiotiques β-lactames agissent par inhibition de la formation des liens inter-peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. La moitié bêta-lactame des pénicillines se lie à l'enzyme (transpeptidase) qui devrait se lier aux molécules de peptidoglycane des bactéries et empêche ainsi la multiplication des bactéries.

32. La streptomycine est un antibiotique antibactérien cytostatique et cytotoxique. Il appartient à la classe des aminosides (ou aminoglycosides) Il fut isolé à partir d'une souche d'actinobactérieStreptomycesgriseus Action par fixation sur la petite sous-unité des ribosomes eubactériens: synthèse protéique aberrante. Effet bactéricide. Le spectre d'action de la streptomycine est assez large puisqu'elle peut agir sur certains bacillesgram négatifs (comme Escherichia coli) ou certains coccigram positifs (comme le Staphylococcus aureus). Cet antibiotique agit également sur Mycobacteriumtuberculosis, et fut d'ailleurs le premier antibiotique contre la tuberculose.

33. La tétracycline est un antibiotique produit par une bactérie du genre Streptomyces. Elle est indiquée contre nombre d'infections bactériennes. La tétracycline empêche la fixation de l'aminoacyl-ARNt entrant dans le site A du ribosome. Effet bactériostatique. Spectre : bactéries Gram positif et Gram négatif

34. Matériel et instruments

35. Matériel et instruments

36. Matériel et instruments

37. Matériel et instruments

38. NON!!!

39. Matériel et instruments PSM: Poste de Sécurité Microbiologique (de type II) Ne pas introduire trop d'objets  perturbe le flux & la sécurité manipulateur Ne pas introduire d'objet poussiéreux  colmate le filtre Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile

40. Matériel et instruments Microscope inversé à contraste de phase

41. Matériel et instruments

42. Matériel et instruments

43. Matériel et instruments Étuve à CO2

44. Technique Aseptique pour culture cellulaire Hygiène: cheveux attaches Se laver les mains avant après. Port de gants blouse Ethanol 70% mais attention à la perméabilité La peau contient naturellement des bactéries et des champignons qui adorent les milieux de culture Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile flasques pipettes Environnement: PSM poste de sécurité microbiologique Nettoyage des hottes: TFD7 ou RBS détergent désinfectant Eau Ethanol Nettoyer les flacons à mettre sous la hotte

45. Congélation/Décongélation Buts Préserver Éviter sénescence Limiter risque de contamination Minimiser les variations génétiques (perte ou doublement des chromosomes) Agents cryo-protecteurs DMSO Glycérol Quand/Comment Phase exponentielle, suspension entre 106 et 108 cellules par mL On congèle dans le milieu complet Temps d’équilibration avec les cryoprotecteurs à la température du laboratoire Congélation graduelle à -40°C/-80°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans l’azote liquide (-196°C) Décongélation rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité Pendant ces phases, on limite les autres stress appliqués aux cellules

46. Fourchette de température critique -15°C/-60°C Jusqu’à -5°C, pas de congélation du milieu ni des liquides intracellulaires Entre -5°C et -15°C, le milieu commence à congeler mais pas les liquides intracellulaires conséquence: les cellules se déshydratent (l’eau intracellulaire sort) Le refroidissement lent permet une déshydratation efficace et limite la congélation intracellulaire qui entraîne la mort de la cellule. Plus les cellules sont grandes et plus le refroidissement en général doit être lent. Cette première condition doit être remplie mais n’est pas suffisante. En effet, il semble que les changements de forme induit par la perte d’eau et ceci en présence de quantité de glace extracellulaire croissantes sont anisotropes (distorsion), ce qui provoquerait des lésions cellulaires. D’autre part, l’augmentation de concentration des solutés serait aussi délétère. Le refroidissement est lent, on augmente la durée d’exposition aux forces de distorsion. Les agents cryoprotecteurs agiraient en diminuant le problème: ils permettent d’augmenter la fraction non congelée et donc limite la déshydratation et l’action des forces de distorsion. La vitesse de décongélation est importante aussi. En général, une décongélation et un réchauffement trop lent sont délétères pour la survie des cellules.