食品中致病菌的检测技术

1. 食品中致病菌的检测技术 第八章

2. 食品中致病菌的检测技术 第一节 食品中肠道致病菌的检测 第二节 食品中致病性球菌的检测 第三节 其他致病菌检验

3. 食品中致病菌的检测技术 第一节 食品中肠道致病菌的检测 一、沙门氏菌的检验 （一）概述 沙门氏菌（Salmonella）广泛分布于自然界，是对人类和动物的重要致病菌。因为多种动物肠道带菌率很高，可由不同方式污染食品，引起食物中毒暴发。在各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌食物中毒屡占首位。 沙门氏菌为需氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，有动力，在周生鞭毛（但有无动力的变种），能在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37℃，最适pH值为7.2～7.6，在固体培养基上37℃,24h菌落可呈中等大小，光滑，圆形，湿润，隆起，在液体培养基内生长均匀混浊。

4. 食品中致病菌的检测技术 在检品中，沙门氏菌含量较少或食品加工过程中使其受到损伤而处于濒死的状态时，为了能够分离出沙门氏菌，需要选用增菌培养的办法，如冻冷食品和加工食品必须经过前增菌，使检品中的沙门氏菌恢复其活力，对未经加工的新鲜食品，不必进行前增菌，可用选择性增菌培养，使沙门氏菌得以增殖，而使大多数的其他细菌受到抑制，再进行分离，可以提高沙门氏菌的检出率。 沙门氏菌的型别种类繁多，现已达2000余种，根据该菌的特征，其检验及鉴定方法需经较为繁杂的手段才能确切的识别，一般分为前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定、血清学分型五个步骤。

5. 食品中致病菌的检测技术 （二）检测方法 1．前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取检样25g（mL），加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000r/min～l0000r/min打碎lmin，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃±l℃培养4h（干蛋品培养l8～24h），移取l0mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液内，于42℃培养l8～24h。同时，另取l0mL，转种于l00mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，于36℃±l℃培养l8h～24h。

6. 食品中致病菌的检测技术 　 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25 g（25mL）加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿（MM）增菌液或四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，于36℃±l℃培养18～24h。 　 2．分离 　　取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋（BS）琼脂平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃±l℃分别培养18～24h（DHL、HE、WS、SS）或40～48h（BS），观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表8-l。

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8. 食品中致病菌的检测技术 3．生化试验 （1）自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表8-2。 表8-2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢（H２S）阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。因此都需要做几项最低限度的生化试验。必要时做图片染色镜检应为革兰氏阴性短杆菌，做氧化酶试验应为阴性。

9. 食品中致病菌的检测技术 （2）在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胰水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36℃±l℃培养l8～24h，必要时可延长至48h，按表8-3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于Al、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。

10. 食品中致病菌的检测技术 ① 反应序号A1 典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸三项中有一项异常，按表8-4可判定为沙门氏菌。如有两项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。 ② 反应序号A2 补做甘露醇和山梨醇试验，按表8-5判定结果。

11. 食品中致病菌的检测技术 ③ 反应序号Bl 补做ONPG。若ONPG（＋），为大肠埃希氏菌，若ONPG（－），为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸（＋），但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸（－）。 ④ 必要时可按表8-6进行沙门氏菌生化群的鉴别。 

12. 食品中致病菌的检测技术 4．血清学分型鉴定 一般采用1.5%琼脂斜面培养物做玻片凝集试验。 O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2.5%～3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于lmL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有03%～0.4%半固体琼脂的小玻管l次～2次，自远端取菌培养后再检查。

13. 食品中致病菌的检测技术 （1）O抗原的鉴定 首先用A～F多价Ｏ血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照，在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。凡A～F多价Ｏ血清呈现凝集者，可依次用Ｏ因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定Ｏ群。如不被A～F多价Ｏ血清凝集者，可用57种或163种沙门氏菌因子血清中的7种多价血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清包括的O群血清逐一检查，以确定O群。如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可将菌苔用生理盐水作成浓菌液煮沸后再检查。

14. 食品中致病菌的检测技术 （2）H抗原的鉴定 根据所确定的O群，依次用H因子血清检查1相和2相的H抗原，对不常见的菌型，可先用多价H血清检查，如其中某种多价血清凝集时，则再用此血清所包括的H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原，如无单因子血清时，要用两个H复合因子血清核对其检查地结果。如仅检出第1相或第2相时，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查，若仍为一相，要用位相变异的方法检查其另一相H抗原。

15. 食品中致病菌的检测技术 常用的位相变异试验方法如下： 小玻管法：将半固体管（每管1～2mL）在酒精灯上溶化并冷却至50℃，取已知相的H因子血清0.05 ～0.1 mL，加入已溶化的半固体内，混匀后，用毛细管吸取分装于供位相变异试验的小玻璃管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按血清1:200～1:800的量加入。于37℃培养后再做凝集试验。

16. 食品中致病菌的检测技术 小倒管法：将两端开口的小玻璃管（下端开口要留一个缺口。不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时将琼脂在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取已知H因子血清l环，加人小套管中的半固体内，略加搅拌，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种l%软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。

17. 食品中致病菌的检测技术 简易平板法：将0.7%～0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。 （3）Vi抗原的鉴定 用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。 5．菌型的判定和结果报告 综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。

18. 食品中致病菌的检测技术 二、志贺氏菌的检验 （一）概述 志贺氏菌（Shigella）是人类重要的肠道致病菌之一，食物源性的痢疾爆发（即志贺氏菌食物中毒），主要是食用了被污染该菌的食品和水所致。 志贺氏菌为需氧性革兰氏阴性无芽胞杆菌，在普通培养基上易于生长，最适pH为6.4～7.8，最适温度为37℃，于10～40℃均能繁殖，在选择性或鉴别培养基上为无色，半透明，微凸起，光滑，湿润，边缘整齐，直径约2mm大小的菌落，但宋内氏志贺氏菌常出现R形菌落。在液体培养基中呈均匀混浊，无鞭毛，无动力。

19. 食品中致病菌的检测技术 志贺氏菌因在食品中的存活期较短，当样品采集后应尽快进行检验，如不能立即检查时，可将标本放入冰箱保存。对该菌的检验至今还没有很好的增菌方法，一般采用GN增菌液，缩短增菌时间，6～8h增菌液内细菌轻微生长，即可接种鉴别平板，以免时间较长，其他肠道非致病细菌生长过多而影响志贺氏菌的分离。用于分离鉴别的培养基，一般不少于两个，采用中等选择性的HE或SS琼脂平板和弱选择性的麦康凯或EMB琼脂平板，以利于志贺氏菌的阳性检出率。

20. 食品中致病菌的检测技术 志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸、不产气（福氏志贺菌6型可微产气），斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内沿穿刺线生长。不发酵水杨苷和侧金盏花醇，不分解尿素，在西蒙氏柠檬酸盐培养基上不生长，V-P为阴性，不发酵乳糖（宋内氏志贺氏菌可迟缓发酵），不能使赖氨酸脱羧，宋内氏菌和鲍氏B型可使鸟氨酸脱梭，其他均为阴性。 检验方法一般分为增菌、分离、生化试验及血清学鉴定。

21. 食品中致病菌的检测技术 （二）检测方法 1．增菌 以无菌操作取检样25g（mL），加入装有225mLGN增菌液的500 mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000r/min～l0000r/min打碎lmin，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2．分离和初步生化试验 （1）取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个；另取l环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板一个，于36℃培养18～24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

22. 食品中致病菌的检测技术 （2）挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24h，分别观察结果。 （3）下述培养物可以弃去： ① 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； ② 在18h～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； ③ 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； ④ 产气的培养物； ⑤ 有动力的培养物； ⑥ 产生硫化氢的培养物。

23. 食品中致病菌的检测技术 （4）凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。 3．血清学分型和进一步的生化试验 （1）血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用Al、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表8-7。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。

24. 食品中致病菌的检测技术 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。

25. 食品中致病菌的检测技术 （2）进一步的生化试验 在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶甘的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。

26. 食品中致病菌的检测技术 已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉籽糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表8-8。 （三）结果报告 综合以上生化和血清学的试验结果，判定菌型并作出报告。

27. 食品中致病菌的检测技术 三、致泻大肠埃希氏菌的检验 （一）概述 大肠埃希氏菌作为正常菌群而存在于人和动物肠道中，并广泛存在于自然界。大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。人和动物的带菌是传播本菌引起食物中毒的重要原因。 致泻大肠埃希氏菌（Escherichia coli），简称致病性大肠菌。根据其致病机制可分为4个类型。肠道致病性大肠菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC），肠道侵袭性大肠菌（Ente roinvasive E·coli，EIEC），产肠毒素大肠菌（Enterotoxigenic E·coli，ETEC），肠道出血性大肠菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）。EPEC主要引起新生儿的腹泻。EPEC、ETEC引起腹泻腹痛型胃肠炎。EIEC引起的胃肠炎酷似痢疾。EHEC引起出血性大肠炎。

28. 食品中致病菌的检测技术 （二）检测方法 1．增菌 样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外，一般不冷藏。以无菌操作取检样25g（mL），加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎lmin或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN值，其余的移人500mL广口瓶内，于36℃±l℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养l8h。

29. 食品中致病菌的检测技术 2．分离 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36℃±l℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 3．生化试验 （1）自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体琼脂、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。

30. 食品中致病菌的检测技术 （2）TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。 TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素等试验中有任一项为阳性培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 4．血清学试验 （1）假定试验 挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表8-9。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。

31. 食品中致病菌的检测技术 （2）证实试验 制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为1:160～1:320的O血清，用0.5%盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在l0mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴锅内，经l6h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。

32. 食品中致病菌的检测技术 5．肠毒素试验 产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内，37C振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL，于37℃l h，以4000r/min 离心l5min，分离上清液，加入0.1硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。 （1）酶联免疫吸附试验检测不耐热肠毒素LT（双抗体夹心法）： ① 包被 先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。

33. 食品中致病菌的检测技术 ② 洗板 将板中溶液甩去，用洗涤液I洗三次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。 ③ 封闭 每孔加100μL封闭液，于37℃水浴中l h。 ④ 洗板 用洗涤液II洗三次，操作同上。 ⑤ 加样本 每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100μL，37℃水浴中l h。 ⑥ 洗板 用洗涤液II洗三次，操作同上。 ⑦ 加酶标抗体 先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴中1 h。

34. 食品中致病菌的检测技术 ⑧ 洗板 用洗涤液II洗三次，操作同上。 ⑨ 酶底物反应 每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光作用5～l0min，加入终止液50μL。 ⑩ 结果判定 以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。 （2）酶联免疫吸附试验检测耐热肠毒素ST（抗原竞争法）： ① 包被 先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，便液体布满孔底。第一孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。

35. 食品中致病菌的检测技术 ② 洗板 用洗涤液I洗三次，操作同上。 ③ 封闭 每孔加封闭液l00μL，37℃水浴l h。 ④ 洗板 用洗涤液II洗三次，操作同上。 ⑤ 加样本及ST单克隆抗体 每孔分别加各试验菌株产毒培养液50μL，稀释的ST单克隆抗体50μL （先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用），37℃水浴l h。 ⑥ 洗板 用洗涤液II洗三次，操作同上。 ⑦ 加酶标记兔抗鼠Ig复合物 先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴l h。

36. 食品中致病菌的检测技术 ⑧ 洗板 用洗涤液II洗三次，操作同上。 ⑨ 酶底物反应 每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光5～l0min，再加入终止液50μL。 ⑩ 结果判定 以酶标仪在波长492nm下测定吸光度（OD）值，计算见下式： （阴性对照OD值－待测样本OD值）/ 阴性对照OD值×100％≥50%为阳性 目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。

37. 食品中致病菌的检测技术 （3）双向琼脂扩散试验检测LT 将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作共做两份，于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30μL。用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经l5～20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。

38. 食品中致病菌的检测技术 （4）乳鼠灌胃试验检测ST 将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36℃培养24h，以3000r/min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30min，每lmL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02mL。将此滤液用塑料小管注人l日～4日龄的乳鼠胃内0.lmL，同时接种3～4只，禁食3～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。 6．结果报告 综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。

39. 食品中致病菌的检测技术 第二节 食品中致病性球菌的检测 一、金黄色葡萄球菌的检验 （一）概述 葡萄球菌（StapHylococcus）是微球菌科的一个属，葡萄球菌属中根据近几年来的报导共有20多个种，其中金黄色葡萄球菌污染食物后，产生肠毒素可引起食物中毒，据报导金黄色葡萄球菌产生肠毒素的菌株约占50%～70%。因此食品中检出金黄色葡萄球菌是食品卫生上的一种潜在危险。 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，在血平板和Baird-Parker氏平板上生长典型菌落，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。血浆凝固酶试验阳性。

40. 食品中致病菌的检测技术 （二）检测方法 1．增菌培养法 （1）检样处理 按无菌操作取检样25g（mL），加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。 （2）增菌及分离培养 吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，36℃±l℃培养24h，转种血平板和Baird-Parker氏平板，36±l℃培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

41. 食品中致病菌的检测技术 （3）培养特性 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Haird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。

42. 食品中致病菌的检测技术 （4）血浆凝固酶试验 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放人小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀，置36℃±l℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及肉汤作为对照。 兔血浆制备：以无菌手续从兔心脏采取兔血约4 mL，注入加有灭菌1mL3.8%柠檬酸钠试管内，混匀。4000r/min离心5min，吸取上清液，即为兔血浆。

43. 食品中致病菌的检测技术 2．直接计数方法 （1）吸取上述1:10混悬液，进行10倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各lmL，分别加入三块Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在36℃±1℃1 h，等水分蒸发后反转平皿置36℃±l℃培养24 h。 （2）在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，36℃±l℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。 （3）菌落计数 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。

44. 食品中致病菌的检测技术 二、溶血性链球菌检验 （一）概述 链球菌（Streptococcus）在自然界中分布较广，可存在于水、空气、尘埃、牛奶、粪便及人的鼻咽腔和肠道，常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及咽峡炎、扁桃体炎、肺炎等，也可引起猩红热、产褥热等急性感染，还可通过食品引起食物中毒。根据其抗原结构，族的特异性“C”抗原的不同，可进行血清学分族。按其在血平板上的溶血情况可分为甲类溶血链球菌、乙类溶血链球菌、丙类溶血链球菌。与人类疾病有关的大多属于乙类溶血链球菌，其血清学分族为A、C、G族，其中A族占90%。

45. 食品中致病菌的检测技术 溶血性链球菌为革兰氏阳性球菌，呈球形或卵圆形，直径0.5～lμm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链。不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。 在血平板上生长有细小菌落，有溶血作用，出现溶血环。乙类溶血链球菌呈完全溶血，甲类溶血链球菌在菌落周围的溶血环中残存红细胞。链激酶试验阳性。

46. 食品中致病菌的检测技术 （二）检测方法 1．检样处理 按无菌操作称取食品检样25g（mL），加入225mL灭菌生理盐水，研成匀浆，制成混悬液；液体检样可直接吸取。 2．一般培养 将上述混悬液或液体检样5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36℃±l℃培养24h，接种血平板，置36℃±l℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

47. 食品中致病菌的检测技术 3．培养特性 该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。乙类溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。 4．链激酶试验 致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

48. 食品中致病菌的检测技术 吸取草酸钾血浆0.2mL（草酸钾0.01g，加入5 mL人血混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾血浆），加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入l8～24h、36℃±℃培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL，（如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%～0.35%），振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中每隔数分钟观察一次，一般约l0min血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动），血浆凝固后，再注意观察及记录溶化时间。溶化时间愈短，表示该菌产生链激酶愈多，含量多时，20min内凝固的血浆即完全溶解。

49. 食品中致病菌的检测技术 不溶解者仍放入水浴24h后再观察，如凝块全部溶解为阳性，如24h后仍不溶解即为阴性。 5．杆菌肽敏感试验 挑取乙类溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板（肉浸液琼脂加入5%脱纤维羊血）上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36℃±l℃培养l8～24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。  

50. 食品中致病菌的检测技术 第三节 其他致病菌检验 一、副溶血性弧菌的检验 （一）概述 （二）检测方法 1．采样时应注意首先准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快迭检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。 对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。