Separační metody Chromatografie

1. Separační metodyChromatografie • objev – ruský botanik M.Cvět – 90.léta 19.stol. • skleněná kolona naplněná CaCO3 – izolace fotosyntetických barviv • znovuobjevení – Martin a Synge 1941 – teoretické základy chromatografie (1952 Nobelova cena) • rozdělení dle skupenství mobilní fáze • kapalinová • plynová • rozdělení dle umístění stacionární fáze • kolonová • plošná – tenkovrstvá • rozdělení dle mechanismu separace

2. Princip kapalinové chromatografie mobilní fáze chromatogram s píky stacionární fáze složky směsi odezva detektoru

3. Základní pojmy • mobilní fáze • stacionární fáze • chromatografická vlna – pík • retenční čas – kvalitativní ukazatel – porovnání se standardy • výška a plocha píku – kvantitativní ukazatel – kalibrační přímka odezva detektoru, mAU šířka píku, min výška píku, mAU plocha píku, mAU.min čas, min

4. Fyzikálně-chemické mechanismy separace sítový efekt – gelová chromatografie adsorpce rozpouštění iontová výměna specifická interakce- afinitní chromatografie

5. Blokové schéma HPLC kolona zásobník mobilní fáze dávkovací ventil detektor vysokotlaké čerpadlo

6. Planární chromatografie • tenkovrstvá – adsorpce • papírová – rozpouštění • rychlá identifikace čistoty látek • retardační faktor R • R= b/a Vypočti hodnoty R pro azobenzen a dimethylžluť na tenké vrstvě silufolu. Po vyvinutí vrstvy byly naměřeny tyto vzdálenosti: 7,5cm pro azobenzen, 4,2 cm pro dimethylžluť. Rozpouštědlo (toluen) vystoupal 10 cm.

7. Schéma plynového chromatografu dávkovač zdroj nosného plynu detektor řídící a vyhodnocovací zařízení kapilární kolona termostatovaný prostor

8. Spektrofotometrické metody Charakteristiky elektromagnetického vlnění • rychlost c, vakuum c= 3·108m/s, prostředí v=c/n • frekvence f • vlnová délka λ=c/f • energie fotonu E= h·f (h=6,6·10-34 J·s) • korpuskulárně-vlnový dualismus λ=h/m·v

9. Výměna energie mezi hmotu a zářením absorpce • ΔE = Ekon- Epoč= h·f absorpce • látka energii přijímá • přechod do excitovaného stavu (10-7-10-8s) • transmitance T, T=Φ/Φ0 • absorbance A, A= log Φ0/Φ = -log T • Lambertův – Beerův zákon A = ε·L·c emise • látka převedena do excitovaného stavu dodáním energie – např.zahřátím • po krátké době spontánní emise fluorescence • zakázaný přechod • λ emitovaného záření je delší než λ absorbovaného elektronové hladiny emise elektronové hladiny

10. Schéma spektrofotometru kyveta se vzorkem zpracování signálu fotodioda zdroj záření monochromátor

11. Výpočty ve fotometrii – Lambertův Beerův zákon • transmitance (propustnost) T, T=Φ/Φ0 • absorbance A, A= log Φ0/Φ = -log T • Lambertův – Beerův zákon: A = ε·L·c • srovnávací metoda – Avzorku/Astandardu=cvzorku/cstandardu • Hodnota transmitance standardního roztoku glukózy (1g/L) byla 0,49. Transmitance roztoku séra je 0,55. Jaká je koncentrace glukózy v séru v mg/L a v mM? (Mr 180). • Standard pro stanovení proteinů má T=0,33 a vzorek séra T=0,44. Jaký je poměr koncentrace proteinů v séru a standardním roztoku.

12. Molární absorpční koeficient ATP je 19,9·103L mol-1 cm-1 při vlnové délce 260nm. Jakou hodnotu A a T lze očekávat při fotometrickém měření 1·10-5 M roztoku ATP v 1cm kyvetě? • Roztok lidského sérového albuminu o koncentraci 1,0mg/ml, který propouští v 1cm kyvetě 70% dopadajícího světla o vlnové délce 280nm, byl použit jako standard pro stanovení koncentrace neznámých bílkovin v roztoku. Vzorek neznámého roztoku bílkovin propouští v téže kyvetě při 280nm 50% světla. Jaká je koncentrace bílkovin ve studovaném vzorku? (1,94mg/ml)

13. Elektromagnetická záření využívaná v analytické chemii

14. Odměrná analýza, volumetrie Princip – k roztoku analytu se přidává roztok činidla o známé koncentraci, které s analytem reaguje. Činidla se přidá takové množství, které je při reakci právě ekvivalentní množství analytu. Z objemu a koncentrace roztoku činidla se stanoví obsah analytu. Pro koncentrace analytu větší než 10-3M. analyt + odměrný roztok ↔ produkty • ekvivalenční bod – analyt a činidlo ve stechiometrickém poměru • subjektivní stanovení: vizuálně – indikátory • objektivní: potenciometricky, fotometricky • titrační křivka – grafické znázornění průběhu titrace • logaritmické, lineární • odměrný roztok (titrační činidlo) • stálý roztok o přesně známé koncentraci • faktor odměrného roztoku

15. Metody odměrné analýzy – druhy titrací Neutralizační titrace • H+ + OH-↔ H2O • acidimetrie – titrace odměrným roztokem kyseliny: HCl, H2SO4, HNO3 • alkalimetrie – titrace odměrným roztokem báze: NaOH, KOH, Ba(OH)2 Srážecí titrace • tvorba málo rozpustné soli: AgCl, BaSO4 • Ag+ + Cl- ↔ AgCl (s) • argentometrie - titrace AgNO3 – stanovení: Cl-, Br-,I-, CN- Komplexotvorné titrace • tvorba málo disociovaného rozpustného komplexu • chelatometrie – titrace kyselinou ethylendiamintetraoctovou EDTA • tvoří komplexy s dvoj-, troj- a čtyřmocnými ionty kovů • stanovení – Ca2+, Mg2+, Fe3+, Zn2+ Redoxní titrace • založeny na přenosu elektronů • oxidimetrie – titrace oxidačním činidlem: např. KMnO4 • reduktometrie – titrace redukčním činidlem: např.TiCl3

16. Titrační křivkatitrace kyseliny silnou bazí

17. Výpočty v odměrné analýze • Jaká je koncentrace HCl v žaludeční šťávě, když na titraci 10,0 mL vzorku bylo spotřebováno 6,5 mL 0,2M NaOH s faktorem 1,05? • Jaká je koncentrace H2SO4 ve vzorku, když na titraci 10mL vzorku bylo spotřebováno 20,6 mL 0,1M NaOH? • Vzorek o neznámé koncentraci NaCl byl titrován odměrným roztokem AgNO3 o koncentraci 0,05M. Jaká je koncentrace NaCl v neznámém vzorku, když na titraci 20,0 vzorku bylo spotřebováno 5,2ml titračního činidla? • Koncentrace síranu železnatého ve vzorku byla stanovována manganometricky titrací 0,05M roztokem manganistanu draselného v kyselém prostředí. Jaká je koncentrace síranu železnatého ve vzorku, když na titraci 20,0ml vzorku bylo spotřebováno 12,2ml odměrného roztoku?

18. Redoxní rovnováha založena na přenosu elektronů oxidace – odevzdávání e- Zn → Zn2+ + 2e- redukce – přijímání e- Cu2+ + 2e- → Cu oxidačně-redukční reakce Zn + Cu2+ ↔ Zn2+ + Cu elektrodový potenciál

19. Standardní potenciály elektrod síla oxidované formy – oxidačních účinků síla redukované formy – redukčních účinků

20. Elektrochemické metody • elektrochemický článek • elektroda • elektrodový potenciál • Nernstova rovnice pro elektrodový potenciál E=E0+RT/nF·ln c(ox) E=E0+0,059/n·log c(ox) • Petersova rovnice E=E0+0,059/n·log c(ox)/c(red)

21. Elektrochemický článek – standardní elektrodový potenciál

22. Typy elektrod Elektrody I.druhu • kovové – Ag elda pro Ag+, Cu elda pro Cu2+ • plynové – vodíková, chlorová elda Elektrody II.druhu • kov pokrytý vrstvou nerozpustné soli od kationtu kovu • argentchloridová (Ag/AgCl), kalomelová (Hg/Hg2Cl2) • referentní Oxidačně redukční (redoxní) elektrody • inertní kov Pt, Au nebo C • měří aktivitu oxidované i redukované formy • Petersova rovnice E=E0+0,059/n·log c(ox)/c(red)

23. Vybrané typy elektrod Pt (Au) elektroda vodíková elektroda argentchloridová elektroda H2 (1atm) solný můstek Ag AgCl platinová čerň pevný KCl roztok kyseliny c=1M solný můstek Pt (Au) drátek

24. Provedení potenciometrického měření voltmetr referentní elektroda indikační elektroda míchadlo magnetická míchačka

25. Praktické měření pH • pH= -log c(H3O+) • skleněná elektroda • membránový potenciál E=0,059 log c(H3O+)ext/c(H3O+)int E= konst - pH • kalibrace 2 popřípadě 3 pufry • Jaký je membránový potenciál buňky? Membránový potenciál buňky je určován koncentrací K+ iontů vně a uvnitř buňky. V mezibuněčném prostoru je 4 mM a v cytoplasmě 155 mM. vnější referentní elektroda vnitřní referentní elektroda skleněná membrána