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酵母单杂交系统

酵母单杂交系统. 吉林大学 植物科学学院 2010 级硕士. 1993 年，由 Wang 和 Reed 等创立发展出一种研究蛋白质和 DNA 相互作用的实验体系。. Wang MM,Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature,1993 , 364(6433):121-126. 酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上， 20 世纪 90 年年代中期又发展起来的 -- 用于核酸和文库蛋白之间的研究.

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酵母单杂交系统

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Presentation Transcript

  1. 酵母单杂交系统 吉林大学 植物科学学院 2010级硕士

  2. 1993年，由Wang和Reed等创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。1993年，由Wang和Reed等创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。 Wang MM,Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature,1993,364(6433):121-126.

  3. 酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点

  4. 酵母单杂交系统原理 将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游 编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达

  5. 转录因子 AD 顺式元件 顺式元件 顺式元件 Pmin 报告基因 转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率

  6. 质粒和菌株 质粒：诱饵质粒pHIS2，文库质粒为pGADT7-rec2 诱饵质粒上连接有目标靶序列，最小启动子和报告基因 文库质粒则和反转录得到的真核生物cDNA连接，可以表达AD杂合蛋白 酵母菌株：Y187 GAL4基因是缺失型的；基因组中引入 额外的报告基因LEU、TRP、 HIS

  7. 报告基因 常用的酵母单杂交体系基本选用HIS3或者LacZ作为报告基因，虽然有的体系将带有报告基因的载体直接整合与酵母染色体上，在大部分实验中报告基因都位于质粒DNA上 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity)

  8. 基本流程 1. 筛选含有报道质粒的酵母细胞 具体过程为： 合成靶序列； 将靶序列插入pHIS2载体的多克隆位点； 一般为将0.1mg pHIS2质粒用EcoRⅠ和SacⅠ进行完全双酶切，T4连接酶连接，靶序 列： pHIS2质粒=5：1的比例进行 酵母转化； 选用乙酸锂法 消除报道基因在酵母细胞中的本底表达； 将插入目标元件的pHIS2质粒转化Y187酵母后，在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp平板进行培养，获得能抑制组氨酸渗漏的最低3-AT浓度，一般不超过45mmol/L

  9. 基本流程 2. 构建表达文库 将样品经过一定处理之后（如胁迫）后，提取mRNA，经过反转录获得cDNA。 一个获取水稻金属应答转录因子的引物： CDSⅢ：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’ SMARTⅢ ：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’

  10. 基本流程 3. 文库质粒、诱饵质粒共转化酵母细胞 重组pGATD7-rec2质粒表达AD杂合蛋白，转化完毕后将菌液均匀涂布于SD/-His/-Leu/-Trp+最低抑制本底HIS泄露浓度3-AT平板上，30℃培养2-7天，获取阳性克隆

  11. 基本流程 4. 阳性克隆的鉴定 用3-AT抗性检测，即提高3-AT浓度，以排除假阳性，取第3步获得的阳性克隆，充分悬浮于200μLTE溶液，涂布于含60mmol/L3-AT +SD/-His/-Leu/-Trp选择性培养基上，只有真正的阳性克隆才能在这种条件下生长

  12. 基本流程 5. 其他 得到的阳性酵母细胞都应当注意保存； 从阳性克隆酵母中抽提文库质粒，转化大肠杆菌进行大量克隆，最后进行测序和序列比对等后续工作

  13. cDNA插入片段 PADH1 GAL4-AD TADH1 LEU2 转化 酵母转化体 Pmin URA3 LacZ DRE DRE DRE DRE 筛选 测序，进一步验证结合活性 挑取阳性克隆

  14. 优点 简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高

  15. 缺点 有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。 如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。

  16. 酵母单杂交系统应用 1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。 Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。 2. 对DNA结合结构域进行分析 如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析. Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。

  17. 谢谢！

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