DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC ŢIILOR VIRALE

1. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE

2. DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR VIRALE Argumente: • clinice (sdr. clinic, debut, evoluţie, patologia asociată) • epidemiologice (vârsta, sex etc.) • laborator

3. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE Indicaţii: • Alegerea terapiei etiotrope • Monitorizarea eficienţei terapiei • Adoptarea măsurilor de profilaxie şi combatere în focar a unor boli contagioase • Supravegherea epidemiologică aunor boli infecţioase

4. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE • Nejustificat(tardiv, fără consecinţe terapeutice)? • Inaccesibil (infrastructură complexă, personal înalt calificat)? • Costisitor ?

5. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE În prezent: • Justificat şi necesar (metode de diagnostic rapid, antivirale eficiente) • Accesibil (cel puţin pentru anumite metode) • Cost / eficienţă

6. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE Indicaţii: • Iniţierea şi monitorizarea terapiei antivirale (v. gripale, HSV1, HSV2, CMV, HIV, HBV, HCV) • Stabilirea conduitei terapeutice sau profilactice (herpes genital prepartum, infecţie cu v. rubeolic, HIV la gravidă)

7. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE • Adoptarea măsurilor de profilaxie şi combatere în focar a unor boli contagioase (HAV) • Supravegherea epidemiologică şi adoptarea măsurilor de sănătate publică (triajul donatorilor de sânge şi organe, supravegherea epidemiilor gripale, SARS) • Evidenţierea unor infecţii noi, virusuri noi sau a unor noi asocieri virus-boală

8. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE Tipuri de laboratoare: • Laboratoare clinice • Institute de Sănătate Publică • Centre de referinţă

9. Metode directe ex microscopic (ME, IF) evidenţierea antigenelor virale evidenţierea secvenţelor ac. nucleic izolarea - identificarea ex. citologic (MO) Metode indirecte evidenţierea anticorpilor specifici DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALEMETODE NESPECIFICE METODE SPECIFICE

10. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE - ETAPE • Cooperarea clinician – medic de laborator! • Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinico-epidemiologic) • Alegerea produsului patologic • Tipul (sdr. clinic, stadiul bolii) • Momentul prelevării • Metoda de recoltare şi transport

11. PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC • Sdr respiratorii: exsudat nazal, exsudat faringian, lichid de spălătură nazală, spută • Sdr digestive: materii fecale, tampon rectal • Rash vezicular: lichid vezicular, produs de raclaj • Infecţii urinare: urină • Infecţii oculare: raclat conjunctival sau corneean, exsudat faringian • Sdr meningian/ encefalitic: LCR, biopsie cerebrală, materii fecale, salivă, ţesuturi • Sânge

12. MOMENTUL PRELEVĂRII ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC OPTIM – primele 2 – 3 zile de la debutul bolii (diagnostic direct)!

13. PRELEVAREA ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC • Tipul produsului patologic • Expediere imediată • Mediu de transport • Refrigerare (+4 +8 ºC), nu congelare (-15 -20 ºC)

14. Lichid amniotic: se aspira lichidul cu seringa si se injecteaza apoi intr-un tub steril. • Scop: cultivare virusuri • Sange periferic: se decontamineaza tegumentul. Se folosesc tuburi cu heparina sodică • Scop: cultivare virusuri • Biopsie cerebrala: probele se transporta in mediu de transport M4 • Scop: cultivare, PCR pentru VHS • Bronhoscopie: se recomanda aspirarea secretiilor prin camera interioara a bronhoscopului intr-un recipient steril cu 1 ml solutie salina. Se transporta imediat la laborator. • Scop: cultivare virusuri

15. Cervix: se foloseste speculum fara lubrifiant. • Se indeparteaza excesul de mucus si puroi cu ajutorul tampoanelor de descarcare. • Se introduce un tampon mic in endocervix si se roteste pentru 15 – 30 secunde. • Se evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. Se comprima usor cervixul intre lamele speculului si se exprima puroiul eventual existent. • Se introduce tamponul intr-un tub de colectie. • Daca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M4. • Scop: cultivare virusuri si PCR

16. Cornee: raclajul corneean este realizat de catre medic. Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transport M4 • Cultivare VHS • LCR: se decontamineaza pielea. Se realizeaza punctie lombara, ventriculara sau suboccipitala. Se strimite LCR intr-un tub steril cu capac insurubat. Nu se foloseste mediu M4. Se transporta in laborator imediat dupa prelevare. • Cultivare virus si PCR pentru Herpes Simplex Virus • Ureche interna: se curata canalul extern cu antiseptic cu actiune medie. Se preleva puroiul aseptic. • Cultivare virus • Ochi (extern): se indeparteaza machiajul. Se antiseptizeaza tegumentul din jurul ochilor cu antiseptic slab. Se trece de 2 ori un tampon umed la nivelul conjunctivei. Evitati atingerea pleoapelor. Se foloseste mediu de transport M4. • Cultivare virus

17. Leziuni herpetice: se sterge viguros baza unei vezicule deschise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de transport M4. • Cultivare VHS, PCR • Biopsie pulmonara: se decontamineaza tegumentul. Se efectueaza doar de catre specialist. Se trimite produsul la laborator in mediu de transport M4. • Cultivare virus • Spalatura nasala / aspirat nasal: capul pacientului este indicat a fi inclinat sub un unghi de 70°. Se aspira in seringa 1 ml solutie salina. Se introduce lichidul in narine. Se colecteaza lichidul si se reintroduce de cateva ori. La final se colecteaza lichidul de spalatura intr-un tub steril insurubat. Se trimite imediat la laborator. Detectarea rapida de virus gripal este posibila in sezon epidemic. • Cultivare virus gripal, virus respirator sincitial.

18. Nasofaringe: se introduce un tampon subtire, in nasofaringe, in cavitatea nasala. Se tine tamponul aproape de septul nasal. Se roteste tamponul si se retrage. Se transporta imediat la laborator. Se foloseste mediu de transport M4. • Cultivare virus; detectare VRS • Lichid pericardic, pleural, peritoneal: se decontami-neaza tegumentul. • Se recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa. Se introduce lichidul intr-un recipient steril, cu capac. • Cultivare virus • Rash: se curata suprafata cu alcool 70%. Se instileaza o cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tub steril. Se foloseste mediu de transport M4. • Pentru rash vezicular se curăţă viguros cu un tampon baza veziculelor proaspete. • Cultivare virus si IF directa pentru V Varicella Zoster

19. Tampon rectal: in timpul proctoscopiei sau sigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acest nivel. Se introduce tamponul in mediu de transport M4. • Cultivare virus • Lichid şunt: se decontamineaza tegumentul si cateterul. Se aspira steril de la nivelul şuntului si se conditioneaza intr-un recipient steril. • Cultivare virus • Materii fecale: se colecteaza in recipiente curate, uscate, cu capac. Daca se recolteaza in plosca, se evita contamina-rea cu urina sau dezinfectante. Transportul nu trebuie sa depaseasca 1 ora. • Cultivare virus. Detectie Rotavirus (e.g. LA).

20. Faringe: tampon de la nivelul exudaului faringian sau al membranelor formate. Se sterg viguros criptele amigdaliene. Nu se atinge mucoasa bucala sau limba! • Cultivare virus • Ţesut: se recolteaza de catre medic • Cultivare virus • Aspirat traheal: secretiile se transporta in container steril. • Cultivare virus

21. Secretie uretrala: se recolteaza la o ora dupa ultima mictiune. Se introduc tampoane subtiri de 2 – 4 cm in uretra si se rotesc timp de 3 – 5 secunde. Se depune tamponul intr-un tub colector. Pentru VHS se foloseste mediu de transport M4. • PCR pentru VHS2; Cultivare VHS • Urina de la nivelul cateterului: se dezinfecteaza tubul cu alcool. Se aspira urina cu o seringa sterila. Se transporta in container steril. Se refrige-reaza imediat. • Cultivare virus • Urina suprapubiana / citoscopie: se realizeaza recoltarea de catre medic intr-un recipient steril; se refrigereaza imediat. • Cultivare virus

22. Vagin: se foloseste speculum cu lubrifiant. Se introduce un tampon steril in vagin. Mediu M4 pentru VHS. • Cultivare VHS, PCR • Vulva: nu se foloseste alcool pentru membranele mucoase. Tegumentul se antiseptizeaza. Se colecteaza cu tamponul sau se aspira cu seringa. Mediu M4 pentru VHS. • Cultivare VHS, PCR

23. Diagnosticul direct • Examinarea directă a produselor patologice • Detectarea de antigene: • Evidentiere de virus / ME si IEM • imunofluorescenţă (IF), • teste imunenozimatice (ELISA – enzime linked immunosorbent assay); • latex aglutinarea (LA); • Detectarea genomului • PCR si RT-PCR

24. Diagnosticul direct • In examinarea directă, produsele patologice sunt examinate pentru evidenţierea: • virusului; • antigenelor virale; • a genomului; • modificărilor histopatologice induse de către infecţia virală.

25. Diagnosticul direct • Avantaje: • examinarea directă este rapidă, • rezultatele fiind obţinute în aceeaşi zi, mai ales în scopul instituirii chimioterapiei. • Dezavantaje: • costul ridicat al tehnicilor, • personalul de laborator înalt calificat, fac din aceste metode apanajul laboratoarelor de cercetare sau special echipate. • Tehnicile de biologie moleculară au devenit, în ultimul timp, din ce în ce mai accesibile, iar sensibilitatea şi specificitatea lor, dublată de automatizarea metodei, depăşesc aceste inconveniente.

26. Diagnosticul direct • Scăderea preţului de cost per determinare reprezintă soluţia de viitor pentru extinderea lor pe scară mai largă. • Prin dezvoltarea tehnologiilor tip DNA chip se vor putea detecta virusuri direct în produsul patologic (PP), cu posibilitatea cuantificării lor, în vederea monitorizării terapiei antivirale.

27. Metode • Microscopia electronică (ME) pentru evidenţierea morfologiei şi dimensiunilor virusurilor şi identificarea acestora utilizând imunoelectron-microscopia (IME). • Microscopia optică: modificări histopatolgice şi evidenţierea de incluzii. • Detectarea genomului viral: hibridizarea şi reacţia de amplificare genică (PCR – polymerase chain reaction).

28. Izolarea virusurilor • Culturi de celule: evidenţierea efectului citopatic (ECP) produs de către virusuri citopatogene; identificarea virusului izolat prin IF, reacţia de neutralizare (RN), testul de hemadsorbţie, RIA, etc. • Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare: evidenţierea de pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA), urmată de identificarea prin RIH. • Izolarea pe animale de laborator determină decesul sau reproducerea bolii la animal, urmată de obţinerea de secţiuni histologice şi examinarea lor prin MO pentru evidenţierea unor leziuni caracteristice şi identificarea de antigene prin RN, RIH, etc.

29. METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC Microscopia electronică (ME) • sensibilitate redusă (106-7 virioni/ml) • personal specializat şi infrastructură complexă • cost ridicat • utilizare limitată

32. Microscopia electronică (ME) • presupune un laborator dotat cu ME cu putere de mărire între 20000-40000X sau 50000-60000X. • Pe lângă dezavantajele legate de echipamentul scump, al necesităţii de personal înalt calificat şi al costurilor ridicate pentru reactivi şi întreţinerea ME, tehnica are şi dezavantajul unei sensibilităţi reduse, deoarece limita de detecţie presupune prezenţa virusului în PP în cantitate de aproximativ 106 particule virale/ml.

33. Microscopia electronică (ME) • Avantaje: • rapiditatea detectării virusurilor şi utilitatea descrierii morfologiei virusurilor; • uneori reprezintă singura metodă de diagnostic, aşa cum s-a întâmplat în cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior, ca agent etiologic al SARS (sindromul acut respirator sever). • Dezavantaje: • sensibilitatea redusă, • cost ridicat, • similitudini morfologice între diferite virusuri, • imposibilitatea identificării serotipului.

34. Microscopia electronică (ME) • Produse patologice utile pentru detecţia de virus: • materii fecale (MF) pentru rotavirusuri, adenovirusuri, virusul Norwalk şi virusurile Norwalk-like, astrovirusuri, calicivirusuri; • lichid vezicular pentru VHS şi VVZ; • produs din leziunile cutanate pentru papillomavirusuri, virusul orf, moluscum contagiosum.

35. Picornavirusuri

36. IME • Creste sensibilitatea si specificitatea ME • Variante ale IME: • IEM clasică: proba este tratată, anterior examinării la ME cu un ser specific cu Ac monoclonali, anti-virus presupus prezent în PP. • Particulele virale, prezente în probe vor aglutina şi în final, se vor agrega, datorită specificităţii reacţiei Ag-Ac; • IEM în fază solidă: grila ME, (sau alt suport), va fi “coafată” cu Ac monoclonali; particulele virale, prezente în PP vor fi adsorbite la suprafaţa grilei prin intermediul Ac-lor.

37. Microscopia optică: Evidentiaza modificări histopatolgice şi evidenţierea de incluzii • Incluziile cu diferite localizări: • intranucleare şi/sau intracitoplasmatice, • eozinofile sau bazofile, • cu variate forme – rotunde, alungite, piriforme, etc. • reprezintă doar un reper orientativ şi nu unul patognomonic.

38. Infectii cu VHS (incluzii IN)

39. Leziuni determinate de VHS. Sageataverdeindicaincluzii IN, ceaalbastra , celulekeratinizate, iarcearosie, celulebinucleate, cu incluziiiN.

40. Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor cu balonizare (aspect generat de VHS, keratinocite, multinucleate).

41. VVZ – incluzii IN

42. V. rabic – incluzii IC (bazofile)Coloratie HE

43. Incluzii Babes-Negrigranule albastru-inchis la nivelul incluziilor (coloratie Sellers)

44. VRS – sincitii si incluzii eozinofile i.c.

45. Infectie HIV – celule nervoaseIncluzii Cowdry A, IN si IC – eozinofile (coloratie HE)

46. joi

47. METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC Detecţia şi identificarea antigenelor virale • imunofluorescenţă • imunohistochimie • metode imunoenzimatice • latexaglutinare • reacţii de neutralizare, fixare a complementului, inhibare a hemaglutinării

48. METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA • Anticorpi marcaţi cu fluorocrom • Detecţia şi identificarea antigenelor de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule)

49. METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA

50. METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE • Detecţia şi identificarea antigenelor virale de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule) • Anticorpi marcaţi cu peroxidază • Examinare la microscopul optic • Dezavantaj – peroxidaza endogenă, prezentă în numeroase ţesuturi, poate genera reactii fals pozitive