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1 基因组文库的构建

第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术. 1 基因组文库的构建 基因组文库（ genomic library ） 将某种生物细胞的整个基因组 DNA 切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的 全部基因 ，称为基因文库。 1. 1 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的 DNA 片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。. 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术.

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1 基因组文库的构建

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Presentation Transcript

  1. 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

  2. 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体 ：载体系列（ 容量为 24 kp ）、cosmid载体（容量为 50 kb ）、YAC（ 容量为 1 Mb ）、BAC（ 容量为 300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

  3. 噬菌体载体构建基因组文库

  4. 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备    应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

  5. PolyAT tract mRNA的分离纯化过程

  6. 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 2.2反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)； 应选用甲基化dCTP； 应保证所获得双链cDNA的方向性。 cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。

  7. EcoRI EcoRI 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 寡聚(dT)12-18 随机6碱基引物R6 寡聚(dT)12-18 随机6碱基引物R6 mRNA (A)n (T)12-18 (A)n (A)n (T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6 第一链合成 (A)n (T)12-18 (A)n (A)n (T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6 第二链合成 加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级 cDNA合成完毕，准备连接 cDNA合成过程示意图

  8. 接头及引物序列 无RNaseH活性的反转录酶，5’甲基化的dNTP XhoI RNaseH，DNA聚合酶I XhoI EcoRI接头，T4连接酶 EcoRI XhoI XhoI酶切 XhoI 完整有方向的cDNA cDNA合成的分子修饰

  9. cDNA文库的构建

  10. 3 RACE技术 端的快速扩增法 cDNA 3′ （3′RACE 法） (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)

  11. 3`-Full RACE法

  12. 端的快速扩增法 cDNA 5′ （5′RACE 法） (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)

  13. 5 ’ RACE原理 ●Self-Ligation 法

  14. 5’ RACE 法种类 • 使用 RNA Ligase 的 5’ RACE 法 • ● Self-Ligation Method • ● Adaptor-Adding Method • 2. 使用TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) 的 5’ RACE 法

  15. Adaptor-Adding Method 原理

  16. TdT 法原理

  17. 几种 5’ RACE 法的比较

  18. 4 酵母双杂交系统 Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 4.1酵母双杂交系统的作用 90年代，纽约大学的S. Field等建立。有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质 4.2酵母双杂交系统的原理 4.2.1 结构域（Domain）合作 许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。

  19. 例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4: 1-147aa 768-881aa N DNA binding domain Active domain C 结合 结合 激活转录 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 实验发现： 转录表达 只要DNA binding domain（DNA-BD）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。

  20. 4.2.2 拆开Domain 用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。 Active domain DNA binding domain 结合 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 不能转录

  21. 4.2.3 重组Domain 用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。 蛋白B Active domain DNA binding domain 蛋白A 4.2.4 观察报告基因表达 通过效应基因是否被激活来检查： 在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。

  22. （1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 GAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。 蛋白B 转录激活domain DNA binding domain 蛋白A 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 不能转录

  23. （2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合 GAL4的DB domain与AD Domain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。 蛋白A 蛋白B DNA binding domain 转录激活domain 激活转录 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 转录表达

  24. 双杂交原理 X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。 Reporter gene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。

  25. 4.3 构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型GAL4基因 使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。 此外还有其他营养缺陷。 如： SFY526; HF7c等菌株。 4.4 构建报告基因（reporter gene） GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。 GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。

  26. 4.5 构建双杂交体系的穿梭质粒 4.5.1 穿梭质粒（shuttle plasmid） 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。 4.5.2 双杂交体系需要两种穿梭质粒 分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。

  27. （1）BD-plasmid 靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。 ADH：Alcohol dehydrogenase 核定位信号是GAL4本身的一部分 筛选标志：TRP

  28. （2）AD-plasmid 外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。 P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。 核定位信号是SV40的T抗原的序列 筛选标志：LEU2

  29. 4.6 酵母双杂交的实验过程 报告基因：HIS（合成组氨酸） 4.6.1 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9） 4.6.2把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424） 4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 4. 6.4筛选观察

  30. （1）存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。 Trp- Leu-

  31. （2）蛋白结合选择 在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子。 His- Trp- Leu-

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