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创新性实验： 中药对肝脏的保护作用

创新性实验： 中药对肝脏的保护作用. 实验目的要求. 学习查阅与研究内容相关的文献资料。 结合完成的基础性实验和综合性实验，学习自行设计实验方案。 学习撰写实验论文. 实验背景. 在传统的中药中有许多补肝保肝的单方与复方，但是，对它们的作用机理研究却明显不足，在正常生理状态下，细胞中的成分和维持正常生理活动的酶活性相对稳定。但是，在细胞受到损害或者不同的生理条件下，细胞中的成分会发生变化。 利用动物肝损伤模型，采用细胞学的实验技术，测定肝细胞中相关指标的变化，为探讨相关中药的作用及其机理提供基础实验数据。. 文献查阅. 常用文献查阅的网站和搜索方法。

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创新性实验： 中药对肝脏的保护作用

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Presentation Transcript

  1. 创新性实验：中药对肝脏的保护作用

  2. 实验目的要求 • 学习查阅与研究内容相关的文献资料。 • 结合完成的基础性实验和综合性实验，学习自行设计实验方案。 • 学习撰写实验论文

  3. 实验背景 • 在传统的中药中有许多补肝保肝的单方与复方，但是，对它们的作用机理研究却明显不足，在正常生理状态下，细胞中的成分和维持正常生理活动的酶活性相对稳定。但是，在细胞受到损害或者不同的生理条件下，细胞中的成分会发生变化。 • 利用动物肝损伤模型，采用细胞学的实验技术，测定肝细胞中相关指标的变化，为探讨相关中药的作用及其机理提供基础实验数据。

  4. 文献查阅 • 常用文献查阅的网站和搜索方法。 • Pubmed:美国国立医学图书馆期刊文献 • Sciencedirect: • 万方数据： • 清华同方CNKI-中国期刊全文数据库 • 重庆维普科技期刊全文数据库

  5. Pubmedhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

  6. Pubmedhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

  7. Pubmedhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

  8. Pubmedhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

  9. Pubmedhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed

  10. Pubmed使用教程 • 复旦大学网站关于Pubmed使用方法的详细讲解： http://202.120.76.227/jiaoyanshi/dzjc/flash/pubmed/page3-3.htm

  11. Sciencedirect：http://www.sciencedirect.com/

  12. Sciencedirect：http://www.sciencedirect.com/

  13. 中文电子资源： 图书馆

  14. 中文电子资源： 电子资源

  15. 中文电子资源： 中文电子资源

  16. 中文电子资源：

  17. 万方数据：

  18. 万方数据：

  19. 万方数据：

  20. 万方数据：Adobe Acrobat Reader

  21. 实验技术路线： • 实验对象：益肝灵 益肝灵具有抗肝毒作用，对四氯化碳、半乳糖、硫化乙酰胺、乙醇等引起的肝损伤，可以通过稳定感细胞膜的作用而保护肝细胞及改善肝脏功能，具有降低血清谷丙氨基转移酶的作用。

  22. 实验技术路线： • 四氯化碳肝损伤动物模型的制备： • (1)取昆明种小鼠60只，随机分成空白对照组、四氯化碳模型组、益肝灵药物处理组3个剂量组以及阳性对照组，每组10只。. • 益肝灵药物处理组每天灌胃(ig)给药1次，四氯化碳组和空白对照组以等容积自来水灌胃，1 d，于末次给药后1 h，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射0．1％四氯化碳油容液10 ml／kg，空白对照组则腹腔注射等量花生油 • 24 h后测定指标，取肝脏匀浆，按照试剂盒操作说明检测肝脏匀浆总谷胱甘肽、GSSG和GSH含量。

  23. 反应原理 • GSH和GSSG检测试剂盒可以分别检测出GSH和GSSG含量的检测试剂盒。 • 通过谷胱甘肽还原酶把GSSG还原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系，前后两个反应合并起来，总谷胱甘肽（GSSG+GSH）就相当于一个颜色产生的限速因素，总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定412nm光吸收值就可以计算出总谷胱甘肽的量。 • 用适当试剂先清除样品中的GSH，然后利用上述反应原理就可以测出GSSG的含量，用总谷胱甘肽（ GSSG+GSH ）的量扣除GSSG的含量，就可以计算出GSH的含量。

  24. 反应原理：

  25. 试剂盒清单 • 总谷胱甘肽检测缓冲液 60ml • 谷胱甘肽还原酶 12微升 • 氧化型谷胱甘肽(GSSG) 5mg • DTNB 4.5mg • 蛋白去除试剂M 1g • NADPH 4mg • DMSO 1.5ml • GSH清除辅助液 0.8ml • GSH清除试剂 160微升 • 说明书1份

  26. 试剂的配制 • GSSG储备液的配制：将试剂盒中5mgGSSG中加入816微升纯水溶解并混匀，即得到浓度10mM的备用液，分装-20℃保存。 • DTNB储备液的配制：将试剂盒中4.5mgDTNB溶解于1.5mlDMSO，即得备用液，分装-20 ℃保存。 • 蛋白去除试剂M溶液的配制：称取0.2g蛋白去除试剂M，加入4ml总谷胱甘肽检测缓冲液，配制成5%的溶液，该试剂必须新鲜配置，当天使用。 • NADPH储备液的配制：将4mgNADPH假如100微升纯水，溶解混匀，分装后-70 ℃保存。

  27. 试剂的配制 • 40倍稀释谷胱甘肽还原酶的配制：取1微升谷胱甘肽还原酶，假如39微升总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀。 • 总谷胱甘肽检测工作液的配制：根据待检样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液，三种试剂按照比例混合，即为总谷胱甘肽检测工作液。

  28. 试剂的配制 • 0.16mg/mlNADPH的配制：取2微升NADPH储备液，加入500微升总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀即为0.16mg/mlNADPH，每检测1个样品需50微升该液体。 • 稀释的GSH清除辅助液的配制：在47微升的纯水中加入53微升GSH清除辅助液，立即混匀。稀释后的清除辅助液不稳定，需新鲜配制，当天使用。 • GSH清除试剂工作液的配制：10.8微升GSH清除试剂中加入89.2微升无水乙醇，立即混匀。新鲜配制，当天使用。

  29. 标准品的准备 • 把10mMGSSG储备液用蛋白去除试剂M溶液稀释成15μMGSSG,再依次稀释成10、5、2、1、0.5μMGSSG溶液，取15、10、5、2、1、0.5六个点做标准曲线。

  30. 待测总谷胱甘肽含量样品的准备 • 组织样品的准备： • 取组织用液氮速冻，然后研成粉末，每10毫克研碎的组织粉末加入30微升蛋白去除试剂M，然后充分涡旋混匀。 • 再加入70微升蛋白去除试剂M溶液，用玻璃匀浆器匀浆（对于比较容易匀浆的组织可以不用液氮速冻处理，而直接加入蛋白去除试剂匀浆）。 • 对处理好的组织样品通常用蛋白去除试剂M溶液稀释5-20倍再进行测定。

  31. 待测GSSG含量样品的准备 • 取部分上述准备好的待测总谷胱甘肽含量的样品，按照每100微升样品加入5微升稀释的GSH清除辅助液,混匀。再按照每100微升加入1微升GSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除工作液，立即混匀。室温反应60分钟。

  32. 样品、标准品的测定 • 使用96孔板，依次加入样品、标准品。加入150微升总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，室温孵育5分钟。加入50微升0.16mg/ml NADPH，25分钟后，490nm下检测光吸收值。

  33. GSSG含量的测定 • 进行GSSG含量的测定时，标准品也必须平行的进行去除GSH的相关操作，以减小误差。 • 如果样品需要同时测定总谷胱甘肽含量和GSSG含量，由于两者的检测体系不同，必须分别单独做标准曲线。

  34. 样品中GSH含量的测定 • 单点测定法：反应25分钟后只测定一次吸光度，根据不同浓度标准品测定的不同吸光度做出标准曲线。样品对照标准曲线即可计算出总谷胱甘肽以及GSSG的含量。 • 实际计算出来的总谷胱甘肽的含量相当于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上还原型谷胱甘肽的含量。 • 例如：总谷胱甘肽的浓度是15μM GSSG的浓度是1.2 μM 那么GSH的浓度为： 15 μM -1.2 μM X 2=12.6 μM 。

  35. 原始实验结果记录

  36. 原始实验结果记录

  37. 原始实验结果记录

  38. 撰写科研论文

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