实验七 微生物的分离纯化与平板菌落计数（一）

1. 实验七 微生物的分离纯化与平板菌落计数（一） 培养基的配制和灭菌

2. 一、目的要求 • 1.了解培养基配制原理，掌握其制备过程。 • 2．了解高压蒸汽灭菌器的原理，掌握使用方法。

3. 二、基本原理 1,培养基 • 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物所需要的营养基质。 • 其中含有碳源、氮源、能源,无机盐、生长因子以及水分。 • 微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH值范围。 • 培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成可分合成培养基和天然培养基和半合成培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基等。

4. 2,灭菌 • 培养基配制后还必须进行灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。 • 消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境中的所有微生物。 • 消毒与灭菌的方法很多，但总的可分为物理法与化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌与湿热灭菌），过滤灭菌、紫外线灭菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。

5. 三、器材 • 药品：按培养基配方（见附录）把需药品一一排好。1mol/L NaOH,1mol/L HCl。 • 其它：pH试纸；试管；三角瓶；量杯；量筒；漏斗；电炉；天平；棉花；纱布；牛皮纸；细绳子等及消毒灭菌用高压蒸汽灭菌锅。

6. 四、操作步骤 • 1.称量：按配方准确称量并放入量杯中，（有些药品需按配方说明先后加入）。 • 2.溶化：在量杯中加入所需水量（一般用自来水，特殊需用蒸馏水），搅匀，加热溶解。 • 3.补水:按配方定容至所需体积。 • 4.调pH值：用pH试纸测pH，并用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节至所需pH范围. • 5.过滤：一般不过滤，特殊情况下需过滤，可用滤纸，纱布或脱脂棉等。

7. 6.分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5口外。注意不要使培养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。 • （1）液体：分装高度以试管高度的1/4左右 • （2）固体：分装试管，其量为管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。 • （3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。

9. 7.灭菌 • 培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。 • 培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用，在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的. • 一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。

10. 五、结果与讨论 1.在一般情况下为什么试管或三角瓶培养基要用棉花塞而不用软木塞或橡皮塞？ • 2.高压蒸汽灭菌过程中为什么一定要排放锅内的冷空气？

11. 各组需要配置的培养基和需要灭菌的玻璃器皿 • 1,干热灭菌 • 培养皿10付(1罐),1ml吸管6支至烘箱中进行干热灭菌(1600C 2h); • 2,制备培养基 • (1)1-5组制备EMB培养基,每组400ml装于2个锥形瓶,另10支9ml试管自来水(用10ml移液管准确量取） • (2)6-10组制备普通营养琼脂培养基,每组400ml分装于10支试管(灭菌后摆斜面)及2个锥形瓶;