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遺伝子の解析 第 2 弾　 DNA シークエンス法

遺伝子の解析 第 2 弾　 DNA シークエンス法. DNA シークエンス （ ABI PRISM ３１０を用いて遺伝子の配列を読む） ABI PRISM ３１０について

ilana
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遺伝子の解析 第 2 弾　 DNA シークエンス法

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Presentation Transcript

  1. 遺伝子の解析第2弾　DNAシークエンス法

  2. DNAシークエンス（ABIPRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む）DNAシークエンス（ABIPRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む） ABIPRISM３１０について ABIPRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞれに、励起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（DyeTerminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径５０μｍのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそれぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。 原理 オートシークエンサー（ABIPRISM３１０）の反応では合成 されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析します。

  3. ～DNAシークエンスの流れ～ PCRにて目的のDNA量を増やす。（同時に蛍光標識も行う） エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製 オートシークエンサーにて目的DNAの塩基配列の読み取り

  4. 塩基 塩基 OH H Ｐ Ｐ デオキシヌクレオチド（ｄNTP）と ジデオキシヌクレオチド（ｄｄNTP） デオキシヌクレオチド（dNTP） ジデオキシヌクレオチド（ddNTP） dNTPとddNTPはPCR法でそれぞれDNAの構成単位として利用されます。違いは３´の位置の水酸基が水素基になっていることです。NにはA,T,G,Cの4種類の塩基が当てはまります。

  5. OH Ｐ Ｐ Ｐ OH H Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 ５´末端 ３´末端 Ｇ A A Ｇ Ｇ A A A A A A dATPが 反応した場合 T Ｇ Ｃ T T 続く T T Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ T T T T ３´末端 ３´末端 ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 ddATPが 反応した場合 伸長反応はStop dNTPとddNTPの伸長反応の違い

  6. A* ５´ ３´ ACGTACG ５´ TGCATGC ３´ ５´ TGCATGC ３´ ５´ ACG* ５´ TGCATGC ３´ ５´ ACGTACG* ５´ TGCATGC ３´ ５´ ACGT* ５´ TGCATGC ３´ ５´ dNTPとddNTPが一緒にあるときにPCR反応をすると・・・・ dNTPをA,T,G,Cとし、ddNTPをA*,T*,G*,C*とする テンプレートDNA PCR反応 A*,T*,G*,C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するのでいろいろな長さ（分子量）のDNA断片が作られる

  7. 塩基 蛍光色素 H Ｐ P P P P H H H H DyeTerminator法 ddNTPの４種類の塩基（A,T,G,C）それぞれに異なった蛍光色素を標識することで4種類のddNTPを見分けることができる。 T A G C

  8. ACC* ACT* ACG* ACA* ５´ ５´ ５´ ５´ TGGATGC TGTATGC TGCATGC TGAATGC ３´ ３´ ３´ ３´ ５´ ５´ ５´ ５´ 蛍光色素で標識することで・・・・・ ほぼ同じ長さ（分子量）だが これら４種類のDNAを 区別することができる

  9. ゲルマトリックス － ＋ ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て＋極へ進みます。DNAの分子量が小さいほど（短いほど）ゲルマトリックスとのふるわれ方が少なく、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差によってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 高分子DNA 低分子DNA

  10. 出来上がったDNA断片 ３´ ACGTACG ５´ TGCATGC ３´ ５´ プライマー AC* ５´ ACGT* ５´ TGCATGC ３´ ５´ TGCATGC ３´ ５´ ACGTACG* ５´ TGCATGC ACGTA* ３´ ５´ ５´ TGCATGC ３´ A* ５´ ５´ TGCATGC ３´ ５´ ACGTAC* ５´ ACG* ５´ TGCATGC ３´ TGCATGC ５´ ３´ ５´ Ex)塩基配列を知りたい（水色部分が知りたい部分）DNA DyeTerminator法を利用してPCRをすると

  11. ACGTACG* ５´ ACGTAC* ５´ ACGTA* ５´ ACGT* ５´ ACG* ５´ ＋ － AC* ５´ A* ５´ PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した（ゲルと同様）キャピラリー管の中で電気泳動をすると 分子ふるい効果 により短い断片 が早く＋極側へ 移動する

  12. 蛍光のついた塩基を早く＋極側についた順に並べると蛍光のついた塩基を早く＋極側についた順に並べると ACGTACG ACGTACG ５´ TGCATGC ３´ ５´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子工学実験ノート　羊土社　　　　　バイオ実験超基本Q&A　羊土社

  13. 実際のシークエンス結果（一部抜粋）

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