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Soluble Factor ( 용해성 인자 )

Soluble Factor ( 용해성 인자 ). Dept. of Oral & Maxillofacial Surgery, Dental Clinic, Gachon Medical School, Ghil Medical Center. Nam Hun Kim. Bone morphogenetic proteins ( 골형태형성단백질 ) 1938 년 Levander: 간엽세포를 활성화 시키는 골형성물질 -> 골형성 1965 년 Urist 자가유도 (autoinduction) 개념을 밝힘 .

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Soluble Factor ( 용해성 인자 )

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Presentation Transcript

  1. Soluble Factor(용해성 인자) Dept. of Oral & Maxillofacial Surgery, Dental Clinic, Gachon Medical School, Ghil Medical Center Nam Hun Kim

  2. Bone morphogenetic proteins (골형태형성단백질) 1938년 Levander: 간엽세포를 활성화 시키는 골형성물질->골형성 1965년 Urist 자가유도(autoinduction) 개념을 밝힘. 1971년 BMP 의 작용에 의해 골형성이 이루어진다는 기본원리 (Osteoinduction) 밝힘 Wodzney 등: BMP 유전자 복제.

  3. Cloning and genealogy Wang et al : 1. Bovine bone 2. trypsin 처리 3. several polypeptides분리해 내어, 4. 아미노산 배열을 결정. 5. Oligonucleotide probes를 얻음. 1) Bovine genomic libraries 또는 cDNA libraries를 검색 용도. 2) Bovine BMP 염기서열을 위한 재조합클론(Recombinant clones)에 사용. 3) Human BMPs 재조합 클론을 인간의 cDNA libraries를 검색 하여 찾기위해 사용 (분자 BMP-1부터 BMP-9 까지는 이러한 방법으로 밝힘)

  4. 추론된 염기서열은 BMP-2부터 BMP-9까지의 분자들이 TGF(Transforming GF)-β family 의 요소라는 것과 보존상태에 따라 여러 가지 subfamily로 나눌수 있음을 보여줌 그림

  5. 1.BMP-2,BMP-4; 2.BMP-3(Osteogenin) ; 3.BMP-5부터 BMP-8 (BMP-7은 Osteogenic protein-1, BMP-8은 Osteogenic protein-2로 각각 불린다.) 4. BMP-8B (Osteogenic protein-3)과 BMP-9. 5. BMP-10부터 BMP-13: :low-stringency hybridization 과 consensus polymerase chain reaction 으로 확인됨. 그림

  6. BMP-12와 BMP-13 분자: GDF-7 (mouth growth and development factor-7) 와 GDF-6의 인간 동소체 (human homologues). GDF-6,GDF-7은 GDF-5와 관련있으며, 쥐의 사지연골과 bone의 발달과 관련됨 BMP-1(Bone morphogenetic protein-1 ): TGF -β family에 속하지 않으며, 단백질 분해효소 TGF-β superfamily 에 속하는 분자가 40여개 이상 그림

  7. TGF-β classification 내의 주요한 subdivisional clan을 상세 분류 1.TGF-β1부터 TGF-β5 까지 2.12개의BMPs ( BMP-1은 제외) , 3.GDF-1부터 GDF-10까지 (BMPs 의 subclass), 4.Inhibins, Activins, Vegetal -related genes, Nodal -related genes, Drosophila genes(eg, dpp, 60A) Gial-derived neurotropic factor.

  8. 보고된 BMP related molecules 의 수는 발전하는 생물학과 임상적 치료법에서의 BMP에 대한 증가된 요구에 맞게 계속적으로 증가하고 있음.

  9. Characteristics TGF-β family의 분자의 구조적인 연구 1.amino-terminal signal sequence을 포함하고 있는 precursor molecule 2.다양한 크기의 pro-domain 으로 합성 1)Amino acid terminal: secretory pathway에 대한 precursor가 목표 2)pro-domain: folding, dimerization, 활동성의 조절 3)mature domain(ie, carboxy terminal fragment): 110-140의 amino acids 와 6개의 cysteine residues를 가지고 있음.

  10. ⁂ 각각의monomeric unit(단량체) 그림 -TGF-β superfamily에 속하는 분자의 경우 거의 동일- 에서 3개의 disulfide bonds형성함. ⁂ BMPs에서 mature domain 은 잘려지고,각각의 monomeric units 은 cysteine-disulfide bridge 에 의해 dimerize 하며, 세포내에서 glycosylate 된다. 그리고 dimer 는 활성형에서 표현됨 ⁂ TGF-β는 glycosylate 되지 않으며, 잠재기에는 보이지 않음. proteolysis 나 낮은 pH 에 의해 세포밖에서 활성화 됨. ⁂ Dimerization은 homodimers 와 heterodimers를 형성할 수 있으며, glycosylation variability 와 함께 활성형에 영항을 주는 요인이 되고, BMPs 에 영향을 미친다.

  11. BMP 의 모식도 Leader region : 아미노산 말단 Propeptide: 전펩타이드 부분 Mature region : 카르복실말단 포도당화된 부분과 Cysteine 부위가 있음.

  12. ⁂ 그러므로 BMPs는 schizophrenic처럼 보이고, 절충적인 성질을 보인다. ⁂ BMPs가 다양한 cellular phenotypes , pathologic & oncologic events 와 관련되지만 pleiotropic effects(다형질 발현효과)를 갖는 형태형성인자의 잠재력으로 보아 임상적으로 중요함.

  13. ⁂ TGF-β의 Receptors 는 Serine/threonine kinase domain을 갖는 transmembrane molecules 로서 , typeI 과 type II 로 불리며, TbRI 과 TbRII 로 적음.(크기에 따라 명명) ⁂ Type I 과 type II receptor는 signaling 하는데 필요한 것으로 보임. 그림 1.type II receptor 는 ligand 와 결합 (ie, TGF-β ) 2.type I receptor에 의해서 인식 3.receptor II 에 의해서 인산화 4.signal transduction을 자극함.

  14. TGF- family 는 type I 과 type II serine-threonine-kinase 수용기에 결합 두 수용기 모두 다 신호전달에 있어 필요함. Type II 수용기는 ligand 에 결합하고, Type I 수용기에 의해 인산화 됨 인산화된 type II 수용기는 신호전달을 신속하게 함.

  15. ⁂ Homogenous receptor binding의 능력에도 불구하고, BMPs 가 적절한 결합과 singnal transduction을 위해서 두가지 receptor 모두의 협력을 필요로 하는 것으로 추측됨. ⁂ 세포반응의 조절이 BMP ligand 와 receptor families 의 combination으로 조절될수 있다는 것을 제안. 1.receptor combination(수용기의 결합)이 동일한 BMP molecule (lignad)과 결합하게함. 2.multimeric recepter complexes(다량의 수용기 복합체)존재함. ⁂ 다양한 다른 serine/threonine kinase receptors,(ie, CFK-43a)가 확인되고 있으며, BMPs 와의 통합된 역할이 organogenesis 에 대한 epithelial-mesenchymal interactions 의 개념에서 연구되고 있음.

  16. Roles (역할) 골형성 단백질은 1.배자(embryo)에서 세포의 발전과 조직과 기관으로 구조화 하는 과정을 감독 2.몸체의 유형과 사지(limb)의 발달 3.골의 형태와 수에 영향 4. postfetal chondro-osteogenetic maintenance를 조절

  17. Urist 는 “골격근의 molcularization”으로 언급한 BMPs 의 역할을 강조 1.무엇이 BMPs를 조절하는가? 2.Organizational conductor(유기적 전도체) 가 BMP expression(발현)에 선행하는가? 3.어떤 세포가 BMP를 expression(발현)하는가?

  18. 1.무엇이 BMPs를 조절하는가? 그림 연골과 골의 분화에서 Reddi 는 "사지와 같은 다양한 해부학적 구조가 완벽한 방식과 대칭적인 형태로 정확한 위치에서 나타난다. “고 하였음. Hox/HOM gene network (ie, vertebrate expression을 조절하는 Homeobox gene complex) 를 candidate regulator로서 선택함. Hox/HOM gene network은 세포에 공간적이고 시간적인 정보를 전해주는 역할을 하는 유전자의 조합으로 cellular phenotype expression, 조직구성 을 조절함.

  19. 2.Organizational conductor(유기적 전도체) 가 BMP expression(발현)에 선행하는가? 최근 Zimmerman et al 은 Spemann orgnizer의 활성을 최소화 하는 polypeptide roggin을 연구함. 그들은 roggin을 섭취했을 때 xeropus 배자내에 BMP-4 가 동족세포표면의 수용기에 결합하기 전에 roggin이 BMP-4에 결합하여 신호전달을 막는다고 결론지음. 따라서 배자내의 방향중추(directional center)에서 나오는 roggin 분비물이 BMP 조절인자인 것 같다. 참고:Spemann organizer ( 외배엽과 척추중배엽의 dorsalization으로부터의 근육의 형성을 위한 신경조직 형성을 지시하는 Xenopus 내의 신호중추)

  20. 3.어떤 세포가 BMP를 expression(발현)하는가? 배자내의 어떤세포가 BMP을 생산하는지에 대한 정보는 부족함

  21. Winner 등은 쥐의 배자에서 whole-mount in situ hybridization을 이용하여 발육중인 심장, 아가미궁, foregut , posterior primitive steak, posterior ventral mesoderm에서 BMP를 발견함. 사지발육동안 in situ hybridization은 BMP-2와 BMP-4를 apical ectodermal ridge(AER) 에 국한시킴. AER은 배자기의 사지(embryonic limb)내의 longitudinal pattern을 결정함. 그림

  22. Hox/MOM gene network, BMPs, AER 에 관한 주제를 제시하기 전에 limb bud embryiogenesis에 관한 다른 marquis region을 언급해야 한다. Hox/HOM gene network, BMPs, ZPA, FGFs, AER 의 pattern-forming consortium 간의 관계를 단일화 시키는 embryonic glue(배자아교)는 shh 이고, 최근에 발견된 의 수용체는 shh를 고정시킴. 그림 이들 요소의 consortium 은 tool kit 의 역할을 하고 이 tool kit 의 혼합수열은 세포-조직-장기 의 위치, 크기, 수, 형태를 만든다.

  23. 이 개념은 쥐의 brachypodism ( GDF-5, GDF-6, GDF-7 의 BMP-like genetic coding 의 돌연변이에 의해 발생된) 에 대한 Storm 등의 연구 short-eared mouse (BMP-5의 genetic coding의 붕괴와 관련된) 에 대한 Kingsley 학파의 연구에 의해 강조됨. 특히 short-ear null mutation 은 사지골격의 형태와 크기의 변화를 야기하지 않고, 귀, 흉골, 늑골과 척추의 형태, 크기의 변화만 야기한다. 반대로, brachypodism null mutation은 사지골의 길이를 줄이고 손, 발가락 분절의수를 감소시키지만 귀, 흉골, 늑골이나 척추에는 영향을 미치지 않는다.

  24. Storm 등은 이 연구를 통해 다음의 결론을 내렸다. 고등동물의 골격은 다양한 BMP-like protein 활성의 다양한 pattern에 의한 모자이크 형태의 구조로 나타난다. 특정한 BMP family member 활성의 변화는 발육과 진화과정에서 골격요소의 형태와 수를 변화시키는 일반적 기전을 이룸. Short-eared 와 brachypodism mutation 의 형태학적 영향에 대해 특이성single gene family 가 어떻게 다른 해부학적 구조의 형성을 조절할 수 있는지를 보여준다. 어느 정도의 BMP family 의 다른 member가 골격발달중의 특정 위치와 단계에서 다른 기능을 대체할수 있는지는 확실하지 않음.

  25. Laufer 등은 Hox/HOM gene network, BMPs, ZPA, AER 과 shh 에 동반하는 사지의 pattern development의 개념을 더욱 강화하는 논문을 발표 그림 최근 연구에 따르면, ZPA에서 오는 신호는 shh나 retinoic acid 이고, AER에서 오는 신호는 fibroblast growth factor-4 (FGF-4) gene product 임. shh는 중배엽에서의 BMP-2 발현과 외배엽에서의 FGF-4 발현을 기시하고 Hoxd-9 gene에서 Hoxd-13gene 까지를 조절하는 것으로 보인다.

  26. 유전자 산물의 복잡한 조절성 조합은 사지형태형성과 위치를 유도하면서 세포분화와 조직생성에 영향을 줌. 배형성기간 동안 기능하는 상호작용 조절성 기질은 ZPA : zone of polarizing activity AER: apical ectodermal ridge shh: sonic hedgehog FGFs: :fibroblast growth factors WNT:WNT gene product Hox/HOM : hox/homeobox gene network BMPs: bone morphogenetic proteins

  27. 저자들은 AER 에 의해 생산된 FGF-4가 두가지 방법으로 ZPA 기능에 영향을 미치는 것을 밝혀냈다. 그림 1. 중배엽내에서 shh 에 의한 gene induction을 필요로 하는 “competence induction"을 통하여 2. shh 발현을 유지하기 위한 positive feedback loop의 방법으로 영향을 미친다. 요약하면, 저자들은 발생기(embryogenesis) 동안에 multiple gene-factor interaction을 설명하기 위해 coordinated thematic concept을 다음과 같이 기술했다.

  28. Induction(유도) 에 의해 shh는 사지(limb)의 외배엽과 내배엽에 신호를 전달한다. shh는 후방으로 치우쳐서 FGF-4가 발현하는 것을 포함하여, AER 형성에 확실한 극성을 부여하고, AER은 계속되는 shh 발현(expression)에 의존함. 그림 중배엽은 그것을 덮고있는 외배엽으로부터 허용된 신호를 받는 이상 1.BMP-2같은 2차신호분자의 발현 (expressing secondary signaling molecules)과 2.Hoxd genes 의 활성화(activating Hoxd gene)에 의해 shh신호에 반응한다.

  29. BMP-2의 발현은 계속되는 shh 발현에 직접적으로 좌우되지만 , Hoxd gene의 발현은 계속될 경우 급속하게 shh 신호에 무관하게 됨(shh independent) Reciprocal fashion 에 의해서 후중배엽에서의 shh expression의 유지는 AER로 부터의 신호에 달려있다. AER에 의해 발현되는 요소들은 shh 발현과 활성의 유지뿐 아니라 유사분열, 성장, 형식화(patterning) 와 필수적으로 연관됨. 상호의존 중추를 통한(interdependent signaling centers) 사지발육의 협조는 형식화된 순서대로 (patterned tandem) 앞-뒤 , 근심-원심의 주조를 갖게한다. 결론적으로 limb patterning의 조절하는 molecular framework을 제공한다.

  30. 발육중인 병아리의 사지에서 BMPs와 patterning을 조절하는 신호경로(signaling pathway)에 대한 Francis 등의 연구는 앞에서의 이론을 확인시켜줌. FGFs 와 WNT가 HOX/Bmp/shh consortium 에 포함되는 것은 body patterning의 복잡성을 조절하는 추가적인 지표가 됨

  31. Pathologic expression (병적인 발현) 골형태형성단백질은 발달 및 기능적 활동에 참여하므로 임상치료에 BMP를 이용하는 것이 강력히 추천되고 있다. 그러나 이 열렬한 임상적 기대를 감소시키는 것은 병적인발현; fibrodysplasia ossificans progressiva, calcifying fibrous epulis, salivary gland pleomorphic adenoma. (진행성 골-섬유 이형성, 석회화성 섬유증, 다형성 타액선암) 때문이다. 확실하지는 않지만 , 수많은 BMP RNAs 가 전립선 암세포에 의해 생성되어, BMP의 발암성에 대한 우려.

  32. 골육종과 BMP의 활성을 함께 기록함. Yoshika 등의 보고에서 골육종의 40%가 골유도성이고 (ie,이들이 피하부위에서 정상적인 이소성 골형성을 증진시켰다. ) 1.Osteoblastic , fibrohistiocytic osteosarcoma 는 BMP, 특히 BMP-2, 4에서 최고수준을 갖는다. 2.미분화 방추형 암세포는 chondroblastic , osteoblastic sarcomas 보다. 더 빈번히 BMP-positive를 나타내었다. ( AbH3b2/17 항체에 의해 결정된) 3.보다 고도로 분화된 osteosarcoma는 BMP-2,4를 덜 발현하는 것 같다.

  33. AbH3b2/17 화학조직면역법을 사용한 선택된 osteosarcoma subtypes의 발견은 다른 골육종과 연골유종, Ewing'sarcoma를 구별하는데 유용한 진단도구가 될 수 있다. 게다가 ,BMP를 expression하는 어떤 변형된 세포의 능력 (ie, 골유종 세포계열, Saos-2)은 Saos-2 세포의 추출물을 쥐의 대퇴골의 부분적 결손을 재생시키는데 사용한 실험에서 이용됨.

  34. BMP의 발암성 때문에 전례없는 치료이익이 기대되는 가운데 우려의 목소리 와 관련된 원리는 무엇일까? BMP의 임상적 적용은 매우 위험한 것인가? BMP가 발암성이 있다는 증거는 아직 없으며, 그보다는 발암과정을 유지시켜 주는 산물일 것이다. 특히 골종양(ie, osteosarcoma)은 1.BMP를 발현(expression)하는 골아세포에 의해 번식되고, 2.BMP는 혈관형성을 증진한다. 혈관형성(Angiogenesis)은 영양분과 대사교환에 매우 중요한 혈관형성(blood vessle formation)의 과정이다. 결과적으로 bone과 cancer의 혈관형성 의존성의 관점에서 bone forming tumor 가 BMP를 발현하는 것이 놀랄만한 일은 아니다.

  35. BMPs 와 임상적용에 관하여 저자중 하나(JOH)는 다양한 동물실험에서 10년간 rhBMP-2를 가지고 연구해 왔으나 발암성의 증거는 없었으며, 임상전이나 제한된 임상연구에서 BMP-elicited oncologic response 가 보고되지 않았다. 골형성단백질은 분화요소(differentiating factor)이다. 이것은 간엽세포의 정상성숙 표현형으로의 분화를 증진시키지만 발암성(oncogenesis)를 증진시키지는 않는다. 게다가 in vitro 실험에서 BMP-7이 발생기의 (embryonic ) 암종세포의 유도와 증식을 방해한다고 한다.

  36. 이전의 보고에서, Hollinger에 의하면 지금까지의 증거에 관계없이 재조합한 강화 BMPs의 long term effect 는 예측될수 없다. BMPs의 치료용량(내인성 추출물의 수준의 몇배 이상) 에서의 downstream effects 는 즉시 표현되지 않는 효과를 전환할 수 있다.

  37. 창상치유(Wound Healing) •골재생의 양은 제한적이므로 많은 경우 골부족은 보완필요 •골재생에 대한 치료법은 발생학과 상처치유의 요소를 공통적으로 포함해야 함. •배형성에서 BMP 의 역할 중요하듯이 BMPs 는 상처치유 활동

  38. 골절치유: 골재생과 임상치료 초기 상처 (initial injury) •상처-> 염증반응 -> 보체의 활성화, 상처부위의 혈관 손상 -> Extravasation, cell signaling (세포 신호전달) •세포외기질(ECM)의 단백용해성 분해 ->화학적 주성물질-> 대식세포와 단핵구 유도 ->대식세포 활성화 -> FGF 유리 -> 내피세포를 자극 ( 전교원효소, 플라스미노젠 활성화) • Degranulating platelet 의 알파과립-> 성장인자의 유리 (다형핵백혈구, 림프구, 단핵구,대식세포를 위한 표지)

  39. •혈액의 응고 혈소판 1. 지혈조절을 위한 기능 2. 신호전달 매개체를 위한 기능.( PDGF, TGF-b, FGF) •상처부위의 환경 산소분압과 pH의 감소(다형핵 백혈구와 대식세포의 활성화에 필요한 조건), •다형핵백혈구 : 미생물의 만연과 미생물 찌꺼기를 제거 대식세포 : 큰 찌꺼기 , 손상부위를 정화 , polykaryon으로 발전, 상처부의 합성능 제공, 세포를 보충, 세포활성을 높이는 성장인자의 제조, 상처 회복단계내내 화학주성과 유사분열 일으킴.

  40. 혈액의 응고, 혈종의 형성 ,지혈성 전색을 형성 응고단계를 조절하는 혈소판은 지혈기능과 신호전달 매개체를 위한 기능을 가짐 파절 3-5일째 까지 신생혈관 , 콜라겐 ,세포로 구성된 Repair blastema (육아조직) 이 발달. 회복중인 상처의 교원질 구성성분은 조절성 인자 (TGF-B, FGF,PDGF) 들과 수용기 세포들에 대한 BMPs를 나타나게 하는 중요한 지시성 기질 초기 개조는 층판골 에 의한 가골과 해면골의 대체 를 포함.호르몬과 (PTH, Calcitonin, GH) 성장인자들은 골파괴와 골형성을 조절함. 후기개조는 하버시안골의 재형성과 형태와 기능의 수복을 이끔.

  41. 증식 •골절후 3-5 일 :새로운 혈관, collagen isotypes, 세포로 구성된 repair blastema(육아조직) 생성 •가골의 기능 :골파편을 안정화 하는 것 . •골절이 고정장치로 유지된 상태: 연골중간기없이 막내골의 경로를 통해 형성 . 안정이 불만족스럽고 골파편이 움직이면 연골이 주로 생김. 안정된다면 재형성된 형태와 기능적 능력을 가지는 골이 재생됨

  42. 개조 (Remodeling) :성숙한 개체에서의 골조직 회복과 항상성에 연관된 역동적 과정 •항상성 개조과정의 종합 : 활성화 –흡수-형성 의 3단계 파골세포는 전달인자 (PTH) 에 의해 활성화 되어 골흡수를 야기함 밝혀지지않은 신호체계 로 흡수중단 파골성 흡수소와(Howship’s lacunnae)에 골아세포 진입 골아세포가 골양조직 분비하고 석회화 골의 재건 피질골의 개조과정 : 파골세포 골내로 진입-> 골아세포 골침착 진행 (이러한 기능적 활성화 단위를 cutting cone이라 함) •사람에서 활성화 –흡수-형성의 과정은 3-6개월 사이에 나타남 시간적 단위 : sigma

  43. 골형태형성단백질과 골재생을 위한 치료 •재조합인간골형태형성단백질 (rhBMP) • rhBMP-2 와 BMP-7 : 1.신생골 형성으로 일반적으로 치유될 수 없는 임계크기의 결손부 에서 골재생을 촉진한다고 보고, 2. 재생된 골은 인접골과 형태적 차이가 없음. •사람에서 BMP를 이용한 제한된 수의 임상연구 rhBMP-2 와 흡수성 교원질스폰지를 이용한 상악동저증대술 시행. 결론: 11명의 환자를 통해 상기재료를 이용한 시술이 기존의 골이식술에 대한 대체시술로 인정될 수 있다 단, 성장인자-매개 혹은 기질-매개 골유도기전은 세포의 존재에 의존함. 세포가 신호에 반응할 수 있어야 하고, 충분한 양의 세포가 존재하여야만 골의 형태와 기능을 재생시키는 결과를 얻을 수 있음.

  44. 골재생을 위한 자가세포치료 •골의 항상성 유지와 파절부의 치유에 전구세포의 역할중요. •골수는 이런 전구세포, Mesenchymal stem cell을 포함 •사람과 동물에서 MSCs를 분리하고 배양,확장하는 기술을 연구 •쥐의 장골에서 정형외과적 부분결손모형에 동유전자의 MSCs를 적용하면 골재생이 증진됨 (그림 2-13) •동유전자의 MSCs를 세포송달매개체와 함께 사용하면 매개체만 사용하여 얻을 수 없었던 분할 부위의 골형성을 얻을 수 있다. (그림 2-14) •배양-확장된 MSCs를 HA/TCP 송달 매개체와 함께 사용하면 8주후에 상당향의 골을 형성

  45. 결론 1.발생기와 창상치유 기전사이에 유사성이 있다는 것은 놀라움. 2.전구세포와 골형태형성단백질이 두과정 모두에서 중요한 역할. 3.골치유과정에 관여하는 세포나 신호분자들을 주입해서 골치유이루는 방법을 연구중. 4.골형성과 골재생의 세포,분자과정에 대해 더많이 이해하게 됨. 이러한 사이토카인을 약리적으로 조절 -> 성인의 치유양상이 태아와 유사하게 됨.

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