1 基因工程载体

1. 第二章基因工程的载体和酶 1 基因工程载体 • 常用基因工程载体有： • 细菌质粒(克隆)； • λ噬菌体(克隆)； • 柯斯质粒(克隆)； • 穿梭质粒(克隆/表达)； • 细菌人工染色体(克隆/表达)； • 酵母人工染色体(克隆/表达)； • Ti质粒及其衍生载体(转化)。 • 用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。 • 高效运送外源基因转入受体细胞, 为外源基因提供复制能力或整合能力以及为表达提供必要的条件。 ☆基因工程中为什么要用载体？ ☆载体越来越小，装载量越来越大

2. 载体的要求: 作为载体，应该具有以下一些性能：A、复制：具有能在受体细胞中复制的复制起点，基因工程的目的是要得到基因的无性繁殖系，并且要求得到最大量的某一基因或基因产物，因此一般要求用属于松弛型的质粒作为载体。细菌质粒ColE1是一种常用的载体；B、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记。ColE1对于大肠肝菌素E1的免疫性却不是一个理想的标记。R质粒具有最适宜于作为选择性标记的多种抗性基因，但不很安全；

3. C、限制性酶切位点：对于某一种限制性酶，它的切点数要求是单一的。现在已发展了许多具有多种单一的限制性酶识别位点的载体；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、外源基因的性状表达：结构基因的表达需要启动子；F、载体的安全性：要求质粒不能随便转移。C、限制性酶切位点：对于某一种限制性酶，它的切点数要求是单一的。现在已发展了许多具有多种单一的限制性酶识别位点的载体；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、外源基因的性状表达：结构基因的表达需要启动子；F、载体的安全性：要求质粒不能随便转移。 ☆什么能够作为载体？怎么做？

4. ori bla 1.1质粒载体 1.1.1What is a plasmid? • A circular piece of autonomously replicating DNA • Originally evolved by bacteria • May express antibiotic resistance gene or be modified to express proteins of interest

5. araC ori pGLO GFP bla The many faces of plasmids Transmission electron micrograph Agarose Gel Graphic

6. 1.1.2质粒的改造 野生的质粒往往不符合作为载体的要求，因此必须对它们进行改造： A、删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。 B、减少限制性酶切点。缺失突变，限制性酶、核酸外切酶核连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。

7. C、加入易于识别的选择性标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。 D、关于质粒安全性能的改造。灭活质粒在细菌之间转移的mob基因。 两个例子pBR322和pUC18/19

8. 常用的抗生素抗性标记基因 注：1、新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因类似卡那霉素(Kanr)。 2、Ampr or Apr, Cmlr or Cmr, Tetr or Tcr.

10. ☆为什么要用2个抗性标记？

11. 抗药性标记选择(插入失活法)

12. 常用的生化遗传标记基因： 1.β-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观； b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化而不影响酶活性； c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大。 2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 3.荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 4.发光蛋白质基因(GFP) 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落发绿色荧光。

13. araC ori pGLO GFP bla pGLO Plasmid • Beta Lactamase • Ampicillin resistance • Green Fluorescent Protein • Aequorea victoria jellyfish gene • araC regulator protein • Regulates GFP transcription

14. ☆ A multiple cloning site (MCS), also called a polylinker, is a short segment of DNA which contains many (up to ~20) restriction sites - a standard feature of engineered plasmids.Restriction sites within an MCS are typically unique, occurring only once within a given plasmid.为什么需要？ ☆lacZ’-β半乳糖苷酶α-肽链（氨基端）

15. 诱导剂IPTG α-肽段 分解X-gal 产物呈现蓝色 lacZ - i P O β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） β-半乳糖苷酶- 调控蛋白P 分解半乳糖

16. -peptide C-terminus of b-galactosiase + X-gal X-gal

17. α-互补(α-complementation)

18. 经Taq DNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM质粒经EcoR V切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。由于T-A克隆只需纯化PCR产物，因而操作较为简便。 pGEM-T vector含丝状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状ssDNA；含有T7和SP6 RNA聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。 pGEM-T Vector图谱 特点: 1.克隆PCR产物 2.通过多克隆区域两侧的T7和SP6 RNA聚合 酶启动子进行体外转录 3.产生ssDNA 4.通过蓝、白菌落筛选重组体 5.多克隆区域提供选择克隆的酶切位点

19. 1.1.3质粒载体的分类及用途 人工构建的载体根据其功能和用途可分为下列6类： A、克隆载体。用于克隆和扩增外源基因，它们或者含有能为氯霉素扩增的松弛型复制子结构，如pBR系列；或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负调控作用，使质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。

20. 质粒pBR322为载体的克隆过程 ☆PCR扩增一个500bp的DNA片段并使用puc18/19作为载体进行克隆，描述棋原理过程和可能出现的问题及解决方法？

21. B、测序载体。这类载体通常高拷贝复制，并含有Polylinker,便于各种DNA片段的克隆与扩增。在Polylinker的两端含有两个不同的引物序列（T3/T5），使得重组质粒经碱变性后即可进行DNA测序反应，如pUC18/pUC19系列。另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子，如M13mp系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外，克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。

22. C、穿梭载体。这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞种复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。 ☆为什么要发展穿梭载体？

23. D、探针载体。这类载体被用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达调控元件的强弱。 ☆如何克隆终止子？

24. E、表达载体。这类载体在Polylinker的上游和下游分别装有转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆的外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pSPORT系列和pSP系列。

25. OC L SC 1.1.4质粒的制备 目前一般使用碱变性法制备质粒，苯酚/氯仿纯化。分离得到的质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现多条带。这是由于不同的DNA构型所引起的。从大到小分别为OC-DNA, L-DNA, CCC(SC)-DNA.

26. 葡萄糖和EDTA 细菌培养过夜 离心收集菌体 加SolutionI SDS和NaOH,PH12.6 加SolutionII 加SolutionIII NaAc,PH4.8 抽提纯化 沉淀干燥 溶解在TE中

27. 图2-2质粒的电泳图(A-E为不同质粒电 泳图，Marker为λDNA的HindIII酶切图)

28. 1.2噬菌体载体 1.2.1λ噬菌体载体类型 什么是噬菌体?----噬菌体是一类细菌病毒的总称,Bacteriophage.见图. 以质粒为基础和噬菌体为基础构建的载体之间的比较.

29. 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌体和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。其中用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。

30. λ噬菌体是研究最清楚的大肠杆菌的一种双链DNA温和噬菌体, 也是最早使用的克隆载体之一. λDNA在噬菌体中是线状DNA分子，全长 48.502kb，60个多基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据.其两端,各有一个长为12bp的互补单链(5'-GGGCGGCGACCT-3'),称为粘性末端.当λ噬菌体进入寄主细胞内后, 其粘性末端能通过碱基互补作用, 形成环状DNA分子. 粘性末端形成的双链区域称为cos位点（cohesive end site), 它是包装蛋白的识别位点, λ噬菌体的包装与DNA特性和其它序列无关, 同时对包装的DNA大小有要求, 包装范围大约在35kb-51kb. 通过改造λ噬菌体, 人们发展了许多不同用途的噬菌体载体.

31. λ噬菌体的基因结构和功能

32. λ噬菌体的生活周期

33. λ噬菌体的改造和构建 基因组太大（49kb），酶切点太多，如有5个BamH1位点（G↓GATCC，只能接纳一定长度的DNA，即相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA， 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞. (1)缩短长度；(2)删除重复的酶切位点增加一些单一的酶切位点； (3)加装选择标记；(4)构建琥珀密码子的突变体，琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。

34. 以λ噬菌体为基础而构建的常用载体可分两类：以λ噬菌体为基础而构建的常用载体可分两类： 插入型表达载体和取代型载体。 插入型载体 替换型载体

35. λ 在Charon 载体中克隆外源DNA

36. λ-DASHII载体的物理图 利用免疫功能正选择取代型载体

37. λ-DNA作为载体的优点 1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。 2.λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。 3.重组λ-DNA分子的筛选较为方便。

38. 1.2.2 M13噬菌体载体 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，其基因组DNA长约6.4kb,成熟的噬菌体为闭合环状单链正链DNA. M13单链DNA的复制型是呈双链环形，此时的DNA可同质粒DNA一样进行提取和体外操作。不论是双链的或是单链的M13DNA，均能感染寄主细胞，产生噬菌斑或形成侵染的菌落.

39. M13噬菌体产生单双链DNA的机制

40. 作为克隆载体的优越性在于能象质粒那样转化进入受体细胞，也可以使用类似于质粒分离纯化方法制备M13 DNA分子，同时又可以采用类似于噬菌体分离纯化方法制备单链M13 DNA，单链DNA在序列测定及定位诱变等中极为有用。

41. 1.1.3噬菌体DNA的分离纯化 培养细菌 加噬菌体侵染细菌 培养细菌 注意裂解 加氯仿 分离DNA 继续培养直到细菌全部裂解 PEG沉淀噬菌体颗粒

42. 1.3质粒-噬菌体杂合载体 1.3.1柯斯质粒（Cosmids) 它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。包装蛋白识别信号cos位点，与待包装DNA性质无关，因此用一个质粒DNA 取代λDNA，就可大幅度地提高外源DNA片段的装载量。 λDNAcos位点及其附近的DNA片段为1.7kb，质粒DNA为3.0kb,由此构建的Cosmid约为5.0kb, 其最大装载量可达45.9kb。

43. 柯斯质粒的优点： 1.具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染进入受体细胞)； 2.具有质粒载体的特性(易于克隆操作、也能转化进入受体细胞、选择及高拷贝等)； 3.具有较高容量（45 kb）的克隆能力； 4.排斥非重组子； 5.不能体内包装，不裂解受体细胞，不形成噬菌体颗粒，因而不形成噬菌斑。 如果通过进一步的分子分析发现得到的质粒是空载体，为什么？

45. 为什么柯斯质粒慢慢的用的很少或不用了？

46. 1.3.2噬菌粒载体(phagemids) 由丝状噬菌体DNA和质粒组成的杂合分子。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。优点：A、具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组子的筛选；B、提高装载量；C、较稳定。

47. 常用的噬菌粒载体pUC18和pUC19 1. 具有较小分子量，可克隆10kb左右的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号便于转化子的选择； 3. 拷贝数高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可通过化学显色反应，筛选重组子； 6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子； 8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 9. 在pUC18和pUC19这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。

48. 用于体外转录 T7 T3

49. 1.4其他载体-人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段，此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区（着丝粒）、稳定区（端粒）与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。

50. 人工染色体载体(artificial chromosome vector)，实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进入高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。