Úvod

1. Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům

2. Úvod Etiopatogeneticky je zásadní role při vzniku diabetu 1.typu (T1D) připisována autoreaktivním T lymfocytům (polarizace ve směru Th1).

3. Úvod - pokračování prediabetes záchyt protilátek manifestace diabetu t Makrofágy, Tc CYTOKINY T-lymf B-lymf ICA, GAD65A, IAA, IA2A CYTOKINY  buňka  buňka

5. Co dělat? Vyléčit – neumíme, léčit – umíme, ALE… Zabránit vzniku – neumíme, ALE… nicméně v každém případě musí být opatření cílená na prevenci realizována nejpozději ve fázi prediabetu…proto také predikce

6. Program predikce diabetu 1.typu • Určení (ne)přítomnosti rizikových alel diabetogenních genů (HLA molekuly II.třídy), cca 40%genetické vnímavosti k T1D  určení celoživotního rizika pro vznik T1D • Protilátky proti GAD65, IA2  určení středně-krátkodobého rizika pro vznik T1D

7. Kategorie genetického rizika DM 1 u prvostupňových příbuzných českých diabetických dětí Cinek O.

9. Co ale ty T lymfocyty?

10. Problém detekce autoreaktivních lymfocytů četnost autoreaktivníchT-lymfocytů v periferní krvi - 1-10 buněk/ 1 mil

11. The Immunology of Diabetes Societywww.idsoc.org

13. Anotované cíle projektu Hlavní cíl: Zavést a standardizovat laboratorní metodu umožňující sledovat přítomnost a intenzitu T buněčné odpovědi zaměřené proti nejdůležitějším známým diabetogenním autoantigenům. Cílem bylo zlepšení diagnostiky osob potenciálně ohrožených vznikem diabetu (z okruhu prvostupňových příbuzných pacientů) a zlepšení sledování efektu imunointervenčních postupů. Vedlejší cíl: Ověřit, zda by popsaná metoda byla využitelná i v dalších aplikacích: Sledování průběhu (stavu T buněčné imunity) po transplantaci pankreatu (včetně event. transplantace ostrůvků) V diagnostice autoimunitního procesu u dospělých pacientů s diabetem 1.typu (LADA diabetes) Hypotéza:cytokinová diagnostika umožní zachytit patologickou Th1 odpověď vůči diabetogenním autoantigenům (IFN-gamma x IL-4)

14. 2003 • Proliferační test aktivace T lymfocytů • intracelulární stanovení cytokinů + stanovení povrchových markerů T lymfocytů • FACS stanovení aktivačních markerů • tetramerová analýza • ELISPOT, ELISA

15. Uspořádání studie Čerstvě izol. PBMNC + autoantigeny Autoprotilátky, C peptid, HLA typ. Klin.a anamn.data Inkubace a pak protein microarrayanalýza cytokinů z kult.supernatantu (+ ELISPOT a ELISA) Reakce? Typ a intenzita.

16. (Auto)antigeny • GAD 65 • GAD a.a. 247-279 509-528 524-543 • IA-2/R2 a.a.853-872 • Proinsulin, B ř. a.a.9-23 • (Hsp277 a.a.277-300) • PHA jako pozitivní kontrola IDS

17. Také ELISPOT +IL-4 Také ELISA

18. Soubor

19. Vstupní kritéria

20. Statistická analýza • Jelikož data nevykazovala normální rozložení, byly pro analýzu užity neparametrické metody. • V rámci statistického vyhodnocení bylo v první fázi byla ověřována hypotéza, zda existuje vliv příslušnosti vyšetřované osoby k určité skupiny na produkci cytokinů a chemokinů v organismu. • Hodnocení bylo provedeno Kruskal Wallisovým testem. Hladina významnosti byla zvolena α=0,05. Pokud byla nalezen statisticky významný rozdíl mezi všemi čtyřmi skupinami, bylo přistoupeno k mnohonásobnému porovnání (jednotlivé skupiny mezi sebou). • Mnohonásobné porovnání bylo provedeno Mann – Whitney U testem s následnou korekcí hladiny významnosti – za signifikantní byly považovány hodnoty p<0,05/6, tj. p<0,0083. • Pro proměnné, které statisticky významně odlišují porovnávané skupiny, bylo snahou nalézt také hladinu, na které jsou skupiny nejlépe odlišeny. Pro nalezení takového bodu byly použity ROC křivky.

21. Výsledky • Produkce cytokinů a chemokinů se mezi sledovanými skupinami lišila a to jak bazální – tak • i po specifické stimulaci. • Naprosto se svými výsledky vydělila skupina prvostupňových příbuzných s pozitivní alespoň jednou autoprotilátkou, tedy skupina, kterou je z hlediska brzkého vzniku diabetu 1.typu riziková.

22. DRL+vs DV

23. ROC křivka pro IL-5 DV vs DRL+ ROC křivka pro IL-13 DV vs DRL+

24. IL-5 a IL-13 %intenzity %intenzity p0,001 (oba) p0,001 p=0,002 p=0,002 p=0,001

25. IL-5 a IL-13 korelace

26. IFN-gamma P=0,006 P=0,003 P=0,006 %intenzity spotu

27. Změna reaktivity po specifické stimulaci jednotlivými autoantigeny • Po stimulaci směsí diabetogenních autoantigenů byly zjištěny následující statisticky signifikantní rozdíly (pozn.byl použit Wilcoxonův párový neparametrický test, kdy za signifikantní je považováno p0,05: • u pacientů s diabetem byl významný pokles v produkci IL-3 (p=0,008) a IL-15 (p=0,038). • U příbuzných bez protilátek byl signifikantní pokles IL-1 (p=0,013) a MCP-2 (p=0,045). • U příbuzných s protilátkami byl pozorován signifikantní nárůst produkce IL-6 (p=0,043). Ve skupině zdravých kontrol nebyly pozorovány statisticky signifikantní rozdíly mezi bazální produkcí a produkcí po stimulaci autoantigeny.

28. Odpověď na stimulaci jednotlivými autoantigenyuváděny průměrné hodnoty pro TNF-beta v pg/ml

29. Rozdílná reaktivita proti jednotlivým autoantigenům u příbuzného s pozitivními autoprotilátkami stanovená metodou ELISA

30. Závěr – část 1 • Pro sledování reaktivity vůči diabetogenním autoantigenům bychom doporučovali na základě našich výsledků vyšetřovat zejména produkci TNF-beta, IL-10 a IL-6 (metodou ELISA resp. ELISPOT). • Pro obecné posouzení chování imunitního systému člověka ohroženého vznikem diabetu bychom doporučili například pomocí proteinové microarray doplnit ještě následující panel cytokinů a chemokinů: IL-2, (IFN-gamma), IL-5,-13, TGF-beta1, GCSF, IL-1alpha, TNF-alpha, IL-15, MCP-2 a MIG. Posuzování specifické reaktivity je jednoznačně vhodnější pomocí jednotlivých autoantigenů než pomocí jejich směsi, i když to klade větší nároky na pracnost. Test musí být proveden za jasně specifikovaných podmínek.

31. Srovnání jednotlivých metod cytokinové a chemokinové detekce

32. Další výstupy projektu

33. Děkuji za pozornost