临床放射生物学

1. 临床放射生物学 李国权 大连医科大学附属二院 肿瘤放疗科

2. 分子放射生物学

3. 传统放射生物学示意图

4. 传统放射生物学的局限性 • 建立在对实验现象进行经验总结基础上的传统放射生物学只是一门相对“宏观”的科学。 • 由于缺乏对细胞辐射损伤及其调控机制的深入了解，这种模式对各种矛盾的实验现象及临床问题难以做出合理的解释，也无法准确阐明和预测不同个体、组织甚至是细胞间的放射敏感性差异。 • 经典的放射生物学需要应用其他学科先进的技术和研究成果来促进自身的发展。

5. 分子生物学与传统放射生物学相结合 • 分子生物学技术的核心是重组DNA技术，该技术一经出现就被放射生物学采纳，成为现代放射生物学研究的主要组成部分。 • 由于电离辐射的最直接作用是损伤细胞的DNA，放射生物学实际上成为分子生物学最前沿的拓展学科。 • 因为现代放射生物学的进步建立在采用分子生物学实验技术及研究成果基础上，因此又被称为分子放射生物学。

6. 电离辐射的靶分子 • 靶分子：DNA、蛋白质 ROS:reactive oxygen species

7. 重要研究方向-分子靶向治疗 靶向性增敏放疗 • 分子放射生物学的研究进展揭示细胞的放射敏感性受控于一系列内部因素和外部因素 ： • 内部因素：细胞周期时相、细胞凋亡启动、DNA损伤修复效率、癌基因和抑癌基因的突变积累 • 外部因素：氧、营养因素、细胞代谢废物的清除 • 对内外因素的深入了解，使人们有可能找出特异性的分子靶点，在不增加正常组织毒副作用的前提下增加放射线对肿瘤细胞杀伤作用。

8. 潜在临床价值的分子靶点 • 细胞周期及周期关卡 • 细胞凋亡 • DNA损伤与修复 • 乏氧研究 • 表皮生长因子受体（EGFR)通路 • 肿瘤血管

9. 细胞周期及调控机制 • 随着人类基因组计划的启动与进展，许多癌基因、抑癌基因相继被克隆。 • 研究表明，绝大多数癌基因或抑癌基因并不直接引起肿瘤，肿瘤是一类多步骤、多基因突变所致的细胞遗传性疾病。 • 几乎所有的癌基因或抑癌基因的功能效应最终都会集中到细胞周期调控机制上来，许多癌基因或抑癌基因直接参与DNA损伤后细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期进程的主要组成部分。 • 癌基因或抑癌基因的突变导致细胞周期启动、运行和终止的异常，使细胞获得以无限增殖为特征的失控性生长。 • 因此，肿瘤是一类细胞周期相关性疾病。

10. 细胞周期

11. 细胞周期 • 细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDKs)与周期素（cyclin） • CDKs的调节

12. 正常细胞周期调控机制 • 细胞周期中S期和M期是最活跃的时相，G1向S过渡期和G2向M过渡期最关键。 • G1时相调控机制（R点）。 • S时相调控机制。 • G2/M时相调控机制。

13. 细胞周期关卡 • 细胞在增殖过程中常遇到各种不利因素，内源性因素：细胞代谢副产物，外源性因素：细胞毒药物或放射线。这些内外因素导致细胞的DNA损伤甚至死亡。 • 细胞受损后保证周期进程高度有序进行的调控机制称为细胞周期关卡（checkpoints）。 • 与细胞关卡功能相一致，受损细胞的周期进程常延缓或阻滞在三个位点： • 细胞进入S期前（G1期关卡） • S期内（S期关卡） • 细胞进入M期前（G2期关卡，或称为G2/M期关卡）

14. G1期关卡 • 电离辐射、缺氧等原因导致的细胞基因组破坏（如DNA单链或双链断裂、各种形式的基因突变等），通过细胞内多种检测途径将基因组改变的信号传递给PI3K相关的丝氨酸/苏氨酸激酶（ATM/ATR)。

15. G2期关卡 • DNA损伤后，损伤信号激活ATM/ATR，进而启动分子作用机制。

16. G2期关卡 • 进一步研究发现存在两种机制上截然不同的G2/M期关卡。 • “早期”关卡：发生在照射后早期，导致的G2/M期阻滞非常短暂，必须有ATM参加，代表的是照射时已经处于G2期的细胞发生的阻滞。可能是细胞由低剂量超敏转成放射抗拒的重要机制。 • “晚期”关卡：发生在照射后数小时，这种阻滞不需要ATM参加，但呈照射剂量依赖性，代表的是照射时处于G2期以前时相的细胞所发生的G2/M期阻滞和积累。该阻滞不受“早期G2/M关卡的影响，但对于缺乏S期关卡的细胞，该组织明显增加。

17. S期关卡 • S期关卡：DNA受损后S期关卡能暂时、可逆的延缓细胞周期进程，其作用是抑制新复制子启动，降低DNA复制速度。因此与G1和G2/M期关卡不同，S期关卡不引起细胞时相的持续阻滞。 • DNA完整性关卡：G1、G2、S期关卡的作用是检测DNA损伤和有缺陷的DNA复制，延缓或阻滞细胞周期的进程，因此统称为DNA完整性关卡。

18. 有丝分裂纺锤体关卡 • 作用：在细胞分裂前确保纺锤体的正确形成。 • 在着丝粒区，纺锤体关卡检测染色体和微管的相互作用，并能够在分裂后期延缓染色体分离，以纠正有丝分裂纺锤体装置的缺陷。

19. 辐射诱导的细胞周期阻滞的意义 • 电离辐射能够导致哺乳动物细胞的细胞周期紊乱，主要表现为细胞周期进程受阻。尽管这一现象在几十年前就被发现，但直到最近随着细胞周期关卡调控机制的阐明，辐射引起细胞周期阻滞的分子机制才有所明确。 • 生物学意义：细胞周期阻滞是细胞对电离辐射的一种保护性反应，目的在于保证基因组的遗传稳定性，促进受损细胞的修复和存活。

20. 辐射诱导的细胞周期阻滞的意义 • 临床意义： • 辐射诱导G1期阻滞的时间长短与辐射后细胞的存活率没有显著的联系，因此G1期关卡对放射治疗的价值目前还不明确； • 在哺乳动物细胞中已发现，某些癌基因转染细胞后，在破坏辐射引起的细胞G2期阻滞的同时，细胞照射后的存活率也明显下降，因此去除放射引起的G2期阻滞理论上能够改善细胞的放射敏感性，G2期关卡是潜在的放射增敏靶点。

21. 阻断G2期关卡的药物分类 • 理论基础：几乎所有的肿瘤细胞在放射后都会出现G2期阻滞，而且G2期阻滞的时间长短与细胞存活之间关系密切。因此用药物对G2期关卡进行调控，人为去除DNA损伤后出现的G2期阻滞，强制性启动细胞周期进程，使细胞在DNA修复之前进入M期并把DNA损伤带入子代细胞，降低肿瘤细胞的存活率。 • 药物分类： • 甲基黄嘌呤类：如咖啡因、己酮可可碱等； • 磷酸酶抑制剂：okadaic acid 、磷曲星、抗生素类药物等； • 蛋白激酶抑制剂：UCN-01、 氨基嘌呤等。

22. P53与细胞周期阻滞 • 抑癌基因P53在人类细胞周期G1关卡中起着关键作用。在所有人类肿瘤细胞中，约50%-60%存在P53基因突变或功能缺失，绝大多数P53功能缺失的肿瘤细胞，由于G1关卡作用的破坏，不能发生G1期阻滞，因而主要表现为G2期阻滞，这为人为干预细胞周期进程意义重大。 • 在放射治疗过程中，对于P53功能缺失的肿瘤细胞，可以把去除放射引起的细胞G2期阻滞作为放射增敏的重要手段。

23. P53突变与放射敏感性 • P53突变在肿瘤细胞多见，人体正常组织细胞无P53突变； • P53突变的肿瘤细胞对放射线抗拒性增加； • G2期阻滞是肿瘤细胞对放射性损伤的普遍反应； • P53突变的肿瘤细胞在DNA受损后只能阻滞在G2期以修复损伤； • 基础研究已经证实去除G2期阻滞能增加肿瘤细胞的放射敏感性；

24. P53突变与靶向性放射增敏 • 全身应用去除细胞周期阻滞药物，理论上仅对受到放射损伤的局部细胞，对于身体其他部位细胞周期进程正常的组织细胞影响较小，这是与常规化疗药物的放射增敏作用相区别的一大优势； • 对于肿瘤周围P53功能正常的组织细胞，在遭受放射性DNA损伤后也可能产生G2期阻滞，但是这种G2期阻滞可能是P53依赖型的，与前述的非P53依赖型的实体瘤细胞G2期阻滞的机制大不相同。更有意义的是，常用的去除G2期阻滞的药物对于P53依赖型的G2期阻滞不起作用。这种差异使我们能够在更高的层次上达到对肿瘤细胞靶向性增敏的目的。

25. DNA双链损伤的信号传导途径 • 感应子（sensor）：直接或间接地感受DNA损伤 • Rad17-RFC(复制因子C) • 9-1-1（Rad9-Rad1-Husl ）复合物 • MRN（Mre11-Rad50-Nbs1） • 传导子（transducer）：传递并放大损伤信号 • ATM/ATR,属于磷脂酰肌醇激酶（PI-3K)家族成员，其主要作用是调节细胞周期关卡和DNA重组修复。 • 效应子（effector):在信号传导通路中被传导子激活，启动细胞周期关卡。 • 转录刺激因子：P53 • 蛋白激酶：Chk1及Chk2 • 介导子（mediator):作用于感应子和传导子或传导子和效应子之间，为蛋白激酶的活化及底物磷酸化牵线搭桥。 • Brcal、Claspin、53BP1及Mdc1

26. ATM基因 • ATM基因缺失导致一种常染色体隐性遗传性疾病，称为共济失调-毛细血管扩张症（A-T) • A-T是罕见的遗传性疾病，患者表现为免疫缺陷，神经系统退行性病多伴随共济失调，肿瘤易感，毛细血管扩张，对放射线极度敏感等多种症状。 • ATM基因在1995年被克隆，其编码一个370kD的蛋白激酶，属于一系列低至酵母高至人类的高度保守的蛋白家族。 • ATM激酶的作用：电离辐射引起的DNA双链断裂可激活ATM的激酶活性，活化后的ATM可磷酸化一系列靶蛋白而启动细胞周期关卡的信号传导途径，从而减缓细胞周期循环，同时诱导DNA修复机制使损伤的DNA得以修复。

27. ATM激酶的分子机制

28. 靶向ATM-放射增敏的新途径 • ATM的主要使命是使细胞对致命性DNA双链损伤作出迅速的保护性反应，其对细胞的存活和保证细胞遗传稳定性具有特别重要的意义。可以想象如果能够调控ATM的功能则有可能改变任何肿瘤细胞的敏感性，使得有些难以通过放疗治愈的肿瘤得以根治。 • ATM作为一个有潜在意义的放射增敏的靶物质还在于其是一种蛋白激酶，在体内通过其羧基末端的激酶区的活性功能而起作用，因此设计一种分子去抑制激酶的活性是相对可行的。

29. 细胞凋亡 • 在肿瘤发展初期，癌基因激活导致抑癌基因P53 激活，从而增加了肿瘤细胞对启动凋亡进程的敏感性； • 随着肿瘤的进展，大部分肿瘤细胞P53 基因突变失活，在放疗后无法启动P53 介导的细胞凋亡进程，导致放射抗拒； • 以P53信号途径为靶点，通过药物重建P53介导的细胞凋亡途径有可能达到放射增敏的目的。

30. DNA损伤的修复 • 碱基切除修复 Base Excision Repair • DNA双链断裂修复 Double Strand Break Repair

31. 碱基切除修复(BER) • 碱基损伤及SSB是辐射导致DNA损伤的最常见类型。 • BER是碱基损伤及SSB修复的主要途径 • 碱基切除修复的类型（BER） • Short-patch途径（主要途径）：只切除1个碱基； • Long-patch途径（次要途径)：切除2-10个核苷酸；

32. DNA双链断裂（DSB)修复

33. 同源重组（HR)Homologous Recombination • 主要发生于S/G2期，以姊妹染色单体为模板 • 修复速度缓慢，高度忠实性的修复途径

34. 非同源重组（NHEJ)Non-Homologous End-Joining • 发生于细胞周期各个时相 • 修复速度迅速，具有修复错误倾向及突变潜能的修复途径

35. 乏氧研究 • 20世纪50年代建立的传统理论：认为乏氧发生在远离血管的细胞中。但在该理论指导下应用高压氧放射增敏、乏氧细胞增敏剂的研究未能取得满意疗效； • 1979年提出的理论：肿瘤内血管畸形，血流发生改变，会导致血管暂时性开放和关闭，使细胞暂时性缺氧。该理论使研究从乏氧细胞增敏剂转向乏氧细胞毒药物的研究； • 目前发现，细胞适应乏氧环境并存活的关键性调节分子是乏氧诱导因子1（HIF1),未来药物开发的对策是寻找能够特异性杀死HIF高表达细胞的药物； • 乏氧研究的另一重要进展是乏氧分子功能影像技术的建立，这些技术如与现行的IMRT及IGRT技术相结合，可望增加乏氧区的放疗剂量，从而提高放疗效果。

36. EGFR通路 • 研究表明，电离辐射能够激活EGFR。1-2Gy的放射剂量可以激活EGFR及其下游的信号传导通路，相当于0.1-1nM的EGFR； • EGFR过度表达与细胞生存、细胞周期进展、分割放疗期间的再群体化相关； • 利用药物在不同水平阻断EGFR的传导通路可以影响辐射抵抗的各种机制：DNA修复、再群体化、抗凋亡信号及肿瘤乏氧。

37. 肿瘤血管 • 研究表明，肿瘤对辐射的反应不但取决于不同的细胞类型，还取决于肿瘤微血管的放射敏感性； • VEGF和PDGF在血管形成中起重要作用，一系列针对VEGF/PDGE的分子靶向药物相继开发并进入临床研究和应用； • 放射治疗和抗血管药物具有协同作用。

38. 展望 • 总之，传统放射生物学在结合了分子生物学后，促进了自身的巨大进步，使人们对肿瘤放射治疗和基础研究中所遇到的问题有了更深刻、更科学的认识，同时也能从更广泛、更实际的角度预测和引导肿瘤放射治疗的研究方向。 • 分子生物学对细胞信号传导途径的研究以及对人类基因功能认识的不断增加为放射肿瘤学的研究注入了新的活力，放射生物学将继续吸收、融合分子生物学在肿瘤及其微环境领域的研究成果，用以发展更加合理、高效的放射治疗手段。