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單源抗體製備與應用

單源抗體製備與應用. 李龍湖 國立中興大學獸醫學系教授 95 年 10 月 12 日. 抗體（ Antibody, Ab ） 抗原（ Antigen, Ag ） 半抗原（ Hapten ） 抗原決定位（ Epitope ）. 多價抗體（ Polyclonal Ab ） 抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子 單源（株、價）抗體（ Monoclonal Ab ） 抗體溶液中僅含一種抗體分子 抗原特異性抗體（ monospecific Ab ） 屬於多價抗體 抗體共同確認特定抗原. 抗體特性比較. 單 源 抗 體 發 展 背 景. 1. B 細胞

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單源抗體製備與應用

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Presentation Transcript

  1. 單源抗體製備與應用 李龍湖 國立中興大學獸醫學系教授 95年10月12日

  2. 抗體（Antibody, Ab） 抗原（Antigen, Ag） 半抗原（Hapten） 抗原決定位（Epitope）

  3. 多價抗體（Polyclonal Ab） 抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子 單源（株、價）抗體（Monoclonal Ab） 抗體溶液中僅含一種抗體分子 抗原特異性抗體（monospecific Ab） 屬於多價抗體 抗體共同確認特定抗原

  4. 抗體特性比較

  5. 單 源 抗 體 發 展 背 景 1. B細胞 ‧B細胞（淋巴球）是產生抗體的細胞 ‧每一個B細胞產生一種抗體分子 ‧脾臟或淋巴結之細胞培養約7天 ‧製造分泌標的抗體分子 2. 骨髓瘤細胞（Myeloma cell, NS1, SP2） ‧ B腫瘤細胞（自然發生） ‧製造分泌未知抗體分子 ‧可株化成株代細胞（cell line） 3. 細胞融合技術（cell fusion） ‧上述兩種細胞融合成融合瘤細胞（Hybridoma）

  6. MAb製備流程圖

  7. 1. 細胞融合（脾臟細胞＋骨髓瘤細胞） 抗原 BALB/C小白鼠 PEG融合劑 培養液（RPMI 1640, DMEM） HAT試藥 骨髓瘤細胞（NS1, SP2） 2. 陽性細胞株篩選與確認 ELISA IFA Western blot 雙重確認

  8. 3. 細胞株化 極限稀釋（Limited dilution） 餵飼細胞 陽性細胞再確認

  9. 4. 單源抗體定性 Isotype 鑑定 免疫沈澱（和抗原特異性結合） 抗體濃度 生物活性測定（如中和作用） 和抗原決定位結合（線狀或構型抗原決定位）

  10. 5. 單源抗體生產與純化 A 細胞上清液收集及抗體純化 抗體濃度低（小於 1 mg/ml） 不含胎牛血清培養液 B BALB/C 小白鼠生產抗體 Pristane處理，一週後注射融合瘤細胞 採集腹水，純化抗體 抗體濃度高（通常為數個 mg/ml）

  11. 6. 細胞保存和解凍 保存液含胎牛血清和抗凍劑10 % DMSO 連續降溫 溫度越低，保存越久 迅速解凍 隔天觀察生長情形及換液

  12. 7. 細胞污染或生長不良處理 黴漿菌污染 抗生素，抗黴菌劑使用 小鼠腹腔接種

  13. 單 源 抗 體 應 用 研究 治療：濃度高，動物使用多 免疫藥理學，免疫基治療等 檢驗試劑 : 病原 食品 藥（毒）物 蛋白質等

  14. 實 例 家禽Reovirus非結構蛋白σNS抗原決定位分析 細菌表現蛋白σNS 免疫 細胞融合 抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色 細胞株化及確認 抗體定性

  15. Table1. Properties of monoclonal antibodies directed against the nonstructural protein σNS of ARV-S1133 *Concentration of ascitic immunoglobulin precipitated with ammonium sulfate was determined according to Bio-Rad Standard Assay Procedures.

  16. N: Native σNS PC: Polyclonal antibody D: Denature σNS NC: Normal control serum

  17. V: Virus-infected cell extracts C: Mock-infected cell extracts 1 to 10: Immunoprecipitates with MAbs 1: 47C, 2: 4A21, 3: 4A125, 4: 4A23, 5: 1F9, 6: 4B9, 7: Gall, 8: 4A123, 9: 5F9, 10: H1E1

  18. A – n A – B Competition (%) = ( ) 100% A: OD without a competiting Ab B: OD with a homologous Ab n: OD with a competitor

  19. Table2. Results of competitive binding assay between monoclonal antibodies to ARV-S1133 nonstructural proteinσNS Competition more than 60%, ++; competition between 35% and 60%, +; competition less than 35%, -. Epitope recognized by MAbs 5F9 and Ga11 was not classified (U).

  20. 1. Poly(A)-sepharose + σNS 2. σNS + MAbs (1:5) 3. σNS + MAbs (1:500) 4. σNS + MAbs (1:5000) 5. Normal serum + σNS 6. σNS + anti-σNS Ab 7. Sepharose + σNS 8. Sepharose + σNS + MAb1F9

  21. MAb capture ELISA for detecting Ab to ARV σNS MAb 1E1 Antigen 1. Expressed ARV σNS (eσNS ) Coating MAb + Crude eσNS preparation Coating purified eσNS 2. Virus-infected CEF lysate Coating MAb + cell lysate Coating cell lysate 3. Conventional ELISA

  22. MAb capture ELISA (crude eσNS preparation)

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