Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica

1. Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de Biotecnología (CSIC) Directores: J.M.Carazo y Fco. Del Pozo

2. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

3. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

4. Propiedades: Solubilidad, peso, tamaño, temperatura de desnaturalización, ... MEFVALGGPDAGSPTPFPDEAGAFLGLGGGERTEAGGLLASYPSGRVS... Introducción al problema biológico Estudios estructurales Proteínas Sustratos Estudios bioquímicos

5. Introducción al problema biológico Microscopio electrónico filamento ánodo columna lente condensadora lente objetivo portamuestras lente proyectadora pantalla fosforescente placa fotográfica

6. proteína ribosoma vírus mitocondria 10 nm. 100 nm. 1 mm. Introducción al problema biológico Rango de estructuras estudiadas por microscopía electrónica de transmisión

7. Introducción al problema biológico Criomicroscopía Tinción negativa

8. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

9. Introducción a la tomografía tridimensional Concepto

10. Introducción a la tomografía tridimensional • Las imágenes de Microscopía Electrónica son imágenes de proyección (Transformada de Rayos X) de la densidad electrónica del espécimen (aproximadamente) Suposición: Objeto de Fase Débil (Weak Phase Object) (La dispersión (scattering) inelástico es tolerable frente al elástico y éste se considera un proceso lineal) Transformada de rayos X donde

11. La distribución de densidad f(r) está determinada de forma única por el conjunto de todas sus integrales de línea . Además, las proyecciones recogidas no responden a las proyecciones exactas de f(r). Introducción a la tomografía tridimensional • Inversión de la Transformada de Rayos X Donde es la proyección de sobre

12. 10 Millones de ecuaciones 1 Millón de incógnitas Introducción a la tomografía tridimensional Algoritmos de expansión en serie

13. Introducción a la tomografía tridimensional Expansión en blobs sobre una rejilla centrada en el cuerpo (BCC)

14. Proyectar Retroproyectar Iterar (n veces) ... - x (k) Introducción a la tomografía tridimensional Técnica de reconstrucción algebraica por bloques (ARTk) G.T. Herman. Academic Press 1980 R.Marabini et al. Uñtramic. 72:53-65 1998

15. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

16. Optimización del proceso de reconstrucción • Reducción del espacio a reconstruir • Optimización del blob y rejilla de reconstrucción • Optimización de parámetros libres mediante simulación • Optimización del orden de las proyecciones • Estudio de normalización

17. Optimización del proceso de reconstrucción Optimización del blob y rejilla de reconstrucción alpha Error alpha Error radio radio E. Garduño et al. Electronic Notes in Theor. Comp. Sci. 462001 S. Matej et al. IEEE Trans. Med. Im.15: 68-78 1996

18. Optimización del proceso de reconstrucción Optimización del blob y rejilla de reconstrucción

19. Optimización del proceso de reconstrucción Optimización de parámetros libres • Simulación del proceso de reconstrucción partiendo de volúmenes conocidos • Phantoms analíticos • Especímenes de estructura atómica conocida C.O.S. Sorzano et al. J. Struct. Biol. 133(2): 108-118 2001

20. Optimización del proceso de reconstrucción • Definición conceptual de (algunas) tareas y de sus Figuras de Mérito (FOM´s) asociadas: • Consistencia estructural: • FOM: Norma L2 y L1 del error • FOM: Coincidencia de medias y varianzas • FOM: Resolución, correlación, información mutua • … • Separabilidad estructural: • FOM: Solapamiento histogramas de fondo y señal • FOM: Separabilidad estadística entre medias • …

21. Optimización del proceso de reconstrucción FOMs: Fourier Shell Correlation (FSC) M. Van Heel, Ultramicroscopy 21:95-100 1987

22. Optimización del proceso de reconstrucción Optimización de parámetros libres • Análisis estadístico intra-experimento • Realizar una serie de reconstrucciones para j • Evaluar cada reconstrucción obteniendo FOM i(j) • Eliminación de elementos no representativos, FOMs cuya media no alcanza una precisión deseada a cada j, y FOMs no correlacionadas con  • Agrupación de FOMs por tendencias • Elección de un representante de clase • Combinación de los representantes de clase • Selección de la región óptima para este experimento • Análisis estadístico inter-experimento • Identificación de variables relevantes • Determinación de un modelo para  frente a dichas variables

23. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

24. Corrección de la función de transferencia del microscopio • Modelo teórico • Estimación del modelo teórico de cada micrografía • Estimación espectral • Ajuste del modelo teórico a dicha estimación • Corrección de la función de transferencia a partir del modelo teórico encontrado

25. Corrección de la función de transferencia del microscopio Función de transferencia J. Frank CRC Press 1996

26. Corrección de la función de transferencia del microscopio Estimación espectral Promediado de periodogramas Modelado autoregresivo y media móvil (+) Menor varianza que promediado de periodogramas (+) Menor región de soporte R. L. Kashyap IEEE Trans. Inf. Theory 30(5): 736-45 1984

27. Corrección de la función de transferencia del microscopio

28. Corrección de la función de transferencia del microscopio Ajuste de parámetros

29. x(-1) Corrección de la función de transferencia del microscopio Corrección de CTF

30. Corrección de la función de transferencia del microscopio Refinamiento Iterativo de Datos G.T. Herman et al. Optical Eng. 29:513-23 1990

31. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

32. Conocimiento a priori • Simetría puntual • Restricciones volumétricas • Superficie • Volumen • Positividad • Solución inicial

33. Planos de simetría para un eje rotacional de orden 6 Conocimiento a priori Simetría La simetría supone el conocimiento de otras proyecciones

34. Conocimiento a priori Restricciones volumétricas

35. Restricciones a nivel volumétrico • Solución inicial • Superficie • Positividad • Volumen

36. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

37. Optimización de parámetros Análisis intra-experimento

38. Optimización de parámetros Análisis inter-experimento

39. SIRT: Parámetro no óptimo ART, SIRT: Parámetro óptimo Optimización de parámetros N. Boisset et al., Ultramic. 74:201-7 1998

40. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

41. Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

42. Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

43. Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

44. Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40 FSC 33Å 15Å 21Å 14Å Frecuencia (1/Å)

45. Contenido • Introducción • Introducción al problema biológico • Introducción a la tomografía tridimensional • Materiales y Métodos • Optimización del proceso de reconstrucción • Corrección de la función de transferencia del microscopio • Conocimiento a priori • Reconstrucción de cristales • Resultados • Optimización de parámetros • Reconstrucción de partículas individuales • Conclusiones

46. Conclusiones • Se ha puesto a punto un paquete de programasen el que las ideas expuestas en la presente tesis están disponibles y ya han sido utilizadas en estudios concretos. • Se ha desarrollado un método de estimación de la función de transfencia de contraste teórica (CTF). • Se ha desarrollado un mecanismo de corrección de la función detransferencia de contraste, tanto en fase como en amplitud. • Se ha desarrollado un método de optimización útil en entornos con una alta variabilidad, un amplio númerode variables independientes y múltiples funciones objetivo a optimizar.

47. Conclusiones • Se han propuesto modelos para una gran variedad de parámetros utilizados durante elproceso de reconstrucción. • Se han incorporado mecanismos de introducción de información apriori en el propio proceso de reconstrucción. • Se han extendido los métodos iterativos de reconstrucción tridimensional a estudios con cristales bidimensionales. • Todas estas aportaciones han contribuido a una mejora de la calidad delos volúmenes obtenidos materializada en una mejora apreciable de la resoluciónalcanzadaen un valor entre 10Å y 15Å de resolución.

49. Introducción

50. 1 6 11 16 21 DnaB: crio-microscopía