החדרת גנים לצמחים בשיטות של הנדסה גנטית

1. נושא 8 שקופיות 43 - 82 החדרת גנים לצמחים בשיטות של הנדסה גנטית • יתרונות החדרת גנים לצמחים בהנדסה גנטית : • מחסום המינים שהיה קיים בהכלאה הקלאסית מתבטל • נוצרה אפשרות להעברת תכונות גם מיצורים אחרים (וירוסים, חיידקים, שמרים, אצות, פטריות ובעלי חיים ). • קיימת אפשרות לייצר ולשחזר צמח שלם טרנסגני מתאים שעברו שינוי גנטי בתרבית.השינוי הגנטי יופיע בכל תאי הצמח . • התהליך מהיר ומתרחש בפרק זמן קצר יחסית בזכותי ההנדסה הגנטית בצמחים ! שחזור צמחים מקלוס 43 http://www-genvagar.slu.se/teknik/djup/vlab1.htm

2. שיטות להחדרת גנים לצמחים להנדסה גנטית • שימוש בחיידק אגרובקטריום • שימוש בנגיף צמחים מהונדס • שימוש במיקרו-הזרקה ישירה לגרעין התא הצמחי • שימוש בתותח גנים או באקדח יורה גנים ( עוברים דופן תא ) • שימוש בשדה חשמלי ( אלקטרופורציה ) • שיטות כימיות – שימוש בפוליאתילן גליקול ( PEG ) אנימציה http://www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/sonicate.htm 44

3. הנדסה גנטית של צמחים בעזרת החיידק אגרובקטריום • חיידק אגרובקטריום : • חיידק סרטני הגורם לגידול סרטני מקומי ( עפץ ) בצוואר השורש של הצמח. • חיידק קרקע (מצוי בקרקע) הזקוק לאופינים ( opines ), תרכובות חנקן ופחמן כמזון. • תוקף את הצמח צמח ע"י חדירה דרך פצעבצוואר השורש ויוצר עפץ מקומי (גידול סרטני) • החיידק משנה ברמת דנ"א את המטבוליזם בצמח ע"י החדרת פלסמיד מסרטן לגרעין תאי הצמח המודבקים. • הגידול מפריש חומרים עתירי חנקן אופינים ( OPINES) לסביבה להזנת החיידק. • הצמח עלול למות בגלל הפניית תוצרי הפוטוסינתזה ליצירת העפץ והאופינים. עפץ http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/34.htm 45

4. עיקרון ההתמרה הסרטנית בצמח ע"י אגרובקטריום : • על הפלסמיד הטבעי Ti יש "אזור אלים" ( Vir ) וקטע דנ"א ( T DNA ) המועבר לתא הצמח. • הקטע המועבר מוגדר משני צדדיו ע"י גבול ימני וגבול שמאלי . • אזור Vir (הנמצא מחוץ לתחום הקטע המועבר ) מתעורר ע"י חומרים המופרשים מפצע בצוואר השורש בצמח. פעילותו כוללת סדרת תהליכים של שכפול אזור T-DNA,עוטף אותו בחלבונים מגינים, ומעביר אותו דרך תעלה שיצר , אל גרעין תאי הצמח ומביא להשתלבותו בדנ"א תא הצמח וגורם להתמרה של התא ולהפרשת האופינים. • הסיבה להתמרה : על קטע ה T-DNA המועבר יש אינפורמציה ליצירת אנזימי ביוסינתזה של אוקסין וציטוקינין ,שהם הורמונים צמחיים הגורמים להתרבות תאי הצמח ובמצב של עודף הם האחראים ליצירת הגידול הסרטני. בנוסף, על T-DNA יש את הגנים לייצור האופינים ( opines )הנחוצים להזנת חיידק האגרובקטריום ולכן ההתמרה הסרטנית בעצם נועדה לייצר מזון עבור החיידק. http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/how.html 46

5. מושגים : • פלסמיד Ti : ( Tumor inducing ) • פלסמיד גדול הנמצא בציטופלסמה של חיידקי הקרקע אגרובקטריום הגורם להופעת גידול סרטני "עפץ "בצוואר השורש של צמח דו-פסיגי . • T- DNA : ( Transforming DNA ) • מקטע ההתמרה . מקטע דנ"א על פלסמיד Ti שיש עליו גנים הגורמים להתמרה הסרטנית של תאי הצמח . גנים המקודדים לאנזימים הבונים אוקסינים וציטוקינינים , הורמונים הגורמים להתחלקות התאים ) . • גבול ימני וגבול שמאלי : • רצפים קצרים זהים כמעט, משני צדי מקטע ההתמרה T- DNA , המגדירים את מקטע T DNA המועבר לתאי הצמח . • אזור Vir: • אזור האלימות . מקטע דנ"א על הפלסמיד Ti (מחוץ למקטע T- DNA ) שיש עליו גנים המכתיבים את הוצאתו והעברתו של מקטע ההתמרה T- DNA לתאי הצמח. • תא צמח מותמר : תא צמח שבכרומוזום שלו מאוחה מקטע מתמיר T- DNA פלסמיד Ti Vir גבול ימני גבול שמאלי T-DNA 47

6. תהליך הדבקת תא צמח בחיידק האגרובקטריום בטבע דרך פצע בצמח תא חיידק אגרובקטריום תא צמח פלסמיד Ti גרעין תא צמח Vir Ti פצע בדופן תא הצמח T-DNA T-DNA 1 4 3 3 2 5 T-DNA עטוף בחלבונים 3. נוצרת תעלה המחברת בין החיידק לתא הצמח להעברת קטע T-DNA כשהוא עטוף בחלבון 1. אזור Vir מתעורר ע"י חומרים המופרשים מהפצע 5. קטע T-DNA משתלב בגנום תא הצמח ומכתיב יצירת ההורמונים והאופינים 4. קטע T-DNA חודר דרך הפצע לתאי הצמח ומגיע לגרעין תא הצמח 2. קטע T-DNA נחתך משני צדדיו ונעטף בחלבון 6 7 6. גנים המקודדים להורמונים צמחיים אוקסין וציטוקינין על קטע T-DNA מתבטאים ומייצרים הורמונים בעודף הגורם לגידול 7. גנים המקודדים ליצירת אופינים על קטע T-DNA מתבטאים ומייצרים אופינים להזנת החיידק 50

7. העשרה http://opbs.okstate.edu/~petracek/CHAPTER%2029%20FIGS/Fig%2029-17a.JPG 48

8. העשרה http://opbs.okstate.edu/~petracek/CHAPTER%2029%20FIGS/Fig%2029-17b.JPG 49

9. העשרה 51

10. הנדסת פלסמיד Ti להחדרת גנים לצמחים • עיקרון השיטה : • מכינים שני פלסמידים קטנים נפרדים : • מכינים פלסמיד מוקטן , מיני פלסמיד, עם קטע T-DNA מהונדס חמוש בגן הרצוי , לאחר שהוצאו ממנו התכונות הסרטניות. • פלסמיד מקורי מוקטן שנותר עם רצף Vir , ללא קטע T-DNA . • מהלך הכנת מיני פלסמיד מהונדס : • מוציאים מהפלסמיד Ti המקורי את קטע T-DNA ומשאירים את הקטע האלים Vir עליו. • נקבל פלסמיד קטן מהונדס "לא חמוש " בגלל שחסר לו הקטע המתמיר (קטע (T-DNA . • 2. מכינים פלסמיד Ti חדש קטן "מיני פלסמיד" חמוש שיש עליו קטע T-DNA עם גבול ימני וגבול שמאלי • (ללא אזור Vir) : • א.ממקטע T DNA מוציאים את הגנים המקודדים לבניית ההורמונים והגנים המקודדים לאופינים • ושמים במקומם גנים לסלקציה - סמני ברירה שהם גנים לעמידות לאנטיביוטיקה (לברירת החיידק המשובט) • ב. מחברים לפלסמיד את הגן הרקומביננטי הרצוי + פרומוטור מתאים חזק • 3. מכניסים חזרה לתא החיידק את שני הפלסמידים : הפלסמיד הלא חמוש נושא Vir + הפלסמיד Tiהמקוצר • והמהונדס עם קטע T DNA רקומביננטי הנושא את הגן הרצוי . 52

11. תהליך הכנת חיידק אגרובקטריום מהונדס להעברת תכונה רצויה לשחזור צמח מהונדס העיקרון : מכינים שני פלסמידים קטנים - אחד עם Vir והשני עם T-DNA מהונדס פלסמיד Ti (ללא T-DNA ) עם אזור אלים Vir 3. הדבקה של צמח מטרה באזור פצע בחיידק המהונדס Vir Vir גבול ימני גבול שמאלי גבול שמאלי גבול ימני T-DNA T-DNA נוצר מיני פלסמיד עם קטע T-DNA חמוש בגן רצוי ללא אזור Vir 4. מוציאים ושמים תאים מודבקים על מצע מוצק סלקטיבי +הורמונים 1. מוציאים: גנים מסרטנים לאוקסין וציטוקינין למנוע יצירת עפץ בצמח המודבק וגם מוציאים גנים לאופינים למנוע הזנת החיידק 2. מחדירים : גן מטרה רצוי + גן לסלקציה עמידות לאנטיביוטיקה + גן מדווח GUS הנותן צבע כחול לתאים שבהם נקלט חיידק אגרובקטריום מהונדס 5. גדל צמח משוחזר מתרבית תאים מותמרים 53

12. העשרה 2. שחזור צמח שלם מהונדס בתרבית 1. מכינים שני סוגי פלסמידים להדבקת הצמח http://opbs.okstate.edu/~petracek/CHAPTER%2029 54

13. גנים חיוניים על המיני פלסמיד המהונדס • קטע T-DNA על המיני פלסמיד ישא : • גן המטרה – גן טרנסגני המיועד להעברה. • פרומוטור מתאים לביטוי הגן. • גן סמן לסלקציה – גן עמידות לאנטיביוטיקה ( קנמיצין ) לצורך ברירת התאים הרקומביננטים . • גן מדווח – גן אינדיקטור כמו גן GUS ( beta-glucuronidase ) הנותן צבע כחול בתאים המכילים את גן המטרה (לא תמיד) או גן פלואורסצנטי ירוק GFP ( Green Florescent Protein ). • רצף סיום http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/how.html החדרת גן מדווח GUS לצמח המתבטא בצבע כחול http://www.wtcc.wur.nl/uk/Technologies/Transformation.htm 55

14. שיטות החדרת גנים לצמחים ליצירת צמח טרנסגני צמח טרנסגני Transgenic apple shoot • צמח טרנסגני – זהו צמח ש : • בגנום שלו יש גן זר של יצור אחר • הגן משולב בגנום התא • הגן יציב • הגן מתבטא • הגן נמצא בכל תאי הצמח בכל הרקמות • הגן עובר בתורשה לצאצאים • הגן הועבר לצמח בשלב העוברי • בשיטות שונות ע"י • הדבקה בחיידק אגרובקטריום מהונדס. • הדבקה בנגיף צמחי מהונדס. • הכנת פרוטופלסט והוספת דנ"א + PEG והפעלת זרם חשמלי ( אלקטרופורציה ) . • מיקרו-הזרקה ישירה לפרוטופלסטים http://www.wtcc.wur.nl/uk/Technologies/Transformation.htm 56

15. החדרת גנים לצמחים ע"י הדבקה בחיידק אגרובקטריום הנושא פלסמיד Ti מהונדס אנימציה 57 http://www.fsbio-hannover.de/oftheweek/113.htm

16. הכנת צמח טרנסגני ע"י חיידק אגרובקטריום מהונדס 1. מכינים חיידקי אגרובקטריום המכילים פלסמיד Ti מהונדס + פלסמיד נפרד נושא Vir • מחדירים חיידקי אגרובקטריום מהונדסים דרך פצע בצוואר השורש של צמח דו-פסיגי • ( במעבדה אפשר להדביק גם רקמת עלה או רקמת גבעול ) 3. חיידקי האגרובקטריום נצמדים לתאי הצמח באזור הפצע ומעבירים לתוכם את מקטע ההתמרה TDNA המהונדס . ( מקטע ההתמרה מוגדר ע"י הגבול הימני והשמאלי ונמצא על מיני פלסמיד רקומביננטי הנושא את הגן הרצוי ונחתך ע"י תוצרי הגנים שבאזור Vir שנמצאים על פלסמיד אחר ) 4. מקטע ה T DNA חודר לגרעין ועובר איחוי עם כרומוזום התא המודבק . 5. באזור הפצע מופיעים תאים המכילים את מקטע ההתמרה המהונדס נושא הגן הרצוי . מעבירים את התאים למצע מוצק בתרבית כדי לברור את התאים המכילים את ה גן המשובט 6. מוסיפים הורמונים במינון מתאים לתרבית ומקבלים שחזור צמח שלם ובריא • הצמח המשוחזר : • צמח טרנס גני • בריא ופורה • מבטא את הגן בכל תאיו בצורה יציבה ומעביר אותו בתורשה לצאצאיו. 58

17. הנדסת צמחים באמצעות חיידק אגרובקטריום מהונדס http://faculty.uca.edu/~johnc/agrobacterium%20engineering.jpg 59

18. אנימציה של הכנת צמח טרנסגני ע"י החיידק אגרובקטריום animation להקליק כאן http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2009 60

19. הנדסה גנטית של צמחים בעזרת נגיף צמחים נדבקים בנגיפים בעיקר בנגיפי RNA . ההדבקה מוגבלת לקבוצת צמחים ולא לצמח ספציפי בודד . ה RNA הנגיפי יכול לשאת אינפורמציה גנטית אוניברסלית ויכול לשמש וקטור להעברת גן רצוי לצמח המודבק. נגיף צמחי TMV ( נגיף RNA ) המדביק צמחי טבק עלי צמח מודבקים בנגיף http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e35/35.htm 61

20. הנדסה גנטית של צמחים בעזרת אקדח גנים או תותח גנים השיטה : הפגזה עם חלקיקי טונגסטן או זהב מצופים דנ"א-גן המטרה, בסיוע לחץ גז גבוה , ישירות לתוך התאים הצמחיים. החלקיקים חודרים דרך הדופן. דנ"א המטרה עובר איחוי עם דנ"א התא. לאחר מכן, מבצעים שחזור צמח שלם . אנימציה של פעולת אקדח גנים animation http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/animations/Gene%20Gun%20Animation/Genegun1.html 62 http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2010

21. 3. הנדסה גנטית של צמחים ע"י מיזוג תאים ( איחוי פרוטופלסטים ) http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29.htm פרוטופלסטים, בהיותם תאי צמח ללא דופן , משמשים בהנדסה גנטית. שיטה א' : מתבססת על כך שפרוטופלסטים קולטים דנ"א מהסביבה. בשיטה של שילוב פוליאתילן גליקול ואלקטרופורציה מתאפשרת קליטת דנ"א לפרוטופלסטים. האלקטרופוציה משפרת את קליטת הדנ"א ע"י PEG מ 0.1% ל 10%. הדנ"א הנקלט משתלב בדנ"א התא ומתבטא. שיטה ב' : יעילה יותר, אך קשה יותר- החדרה ישירה של דנ"א ,דרך קרום הפרוטופלסט , ע"י מיקרו -הזרקה ישירה לגרעין התא. היעילות של השיטה 30% . לאחר מכן, מבצעים שחזור צמח שלם מהונדס ע"י : א. ברירת הפרוטופלסטים הרקומביננטיים הרצויים שקלטו דנ"א זר. ב. מחדשים את בניית דופן התאים בחזרה . ג. משחזרים מהם צמח מהונדס שלם. 63

22. סיכום והשוואה של השיטות השונות להחדרת גנים לתאי צמח הדבקת תאים בחיידק אגרובקטריום מהונדס גנטית החדרה ישירה של גנים לפרוטופלסטים בתרבית. בתנאי שניתן לשחזר אח"כ צמח שלם פורה ובריא . השיטות הן שונות : הדבקת תאים בוירוסים צמחיים מהונדסים גנטית • יתרון : • קל להדביק צמח בוקטור • וירוס צמחי • חסרונות: • ההדבקה בנגיף מוגבלת • מבחינת מספר הצמחים • הניתנים להדבקה • ניתן להחדיר מקטעי דנ"א • קצרים בלבד • התכונות החדשות לא • מועברות (הצמח לא טרנסגני) • יתרונות: • מתקבל צמח טרנסגני שבו : • הגן מתבטא בכל התאים • הגן יציב במשך כל חיי הצמח • הגן מועבר בתורשה לצאצאים • חסרון : • החיידק תוקף רק צמח דו-פסיגי • כאשר מזון האדם מקורו יותר • בצמחים חד-פסיגיים כמו אורז • , חיטה, שעורה ו תירס החדרת דנ"א ע"י אלקטרופורציה + PEG החדרת דנ"א ע"י מיקרו הזרקה החדרת דנ"א ע"י PEG פוליאתילן גליקול בטמפ' 30 מעלות יתרון : יעילות 30% • בוררים תאים • מחדשים בניית דופן • שחזור צמח שלם יתרון : יעילות גבוהה 10% יתרון : איחוי דנ"א בפרוטופלסט מוביל לצמח טרנסגני חסרון: % הקליטה נמוך 0.1-1% חיסרון : השיטה לא עובדת בדגניים יש מגבלות. 64

23. העשרה סיכום הגישות לשינוי גנטי בתרביות צמחיות http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/2.htm 65

24. תחומי יישום של החדרת שינויים גנטיים בצמחים הקניית עמידות לנגיפים הקניית עמידות לחרקים הקניית עמידות לקוטלי עשבים שינוי גנטי בצמחים : שינוי מכוון בגנום ע"י העברה של מידע תורשתי דרך מחסומי המין המקובלים, יכול לקצר תהליך השבחה ויצירה מהירה של מינים חדשים בעלי תכונות משופרות בחקלאות הבעיה הכללית : קושי בביטוי הגן המוחדר בגלל מנגנוני בקרה מורכבים השולטים על וויסות ביטוי הגן ובגלל תהליכי עיבוד לאחר ביטוי הגן וקבלת חלבון פעיל. הבעיה הספציפית לצמחים : התכונות המבוקשות בחקלאות הן כמותיות ונקבעות ע"י מספר גנים. בינתיים התכונות המהונדסות הן דומיננטיות ונקבעות ע"י גן יחיד: תכונות העמידות ו- תכונות שיפור איכות תזונתית (חלבון מתוק יותר או חלבון עשיר יותר בחומצות אמיניות ) תכונת העמידות בצמחים לקוטלי עשבים נובעת ממוטציה דומיננטית יחידה ולכן ניתנת להעברה לצמחים חסרי עמידות כדי להקנות להם תכונה זו. (למרות שהבסיס הביוכימי והגנטי לא ברור עדיין ) יש צמחים מוטנטים המפתחים עמידות ספונטאנית לקוטלי עשבים 66

25. דרכים להקניית עמידות להדברה כימית (קוטלי עשבים כימיים) להגדלת הייצור החקלאי דרך 2 דרך 1 הקניית יכולת נטרול קוטל העשבים הכימי ע"י החדרת גנים המנטרלים את החומר הכימי באמצעות אנזימים שינוי ברגישות (1) או בכמות (2) חלבון אנזים המטרה המושפע מקוטל העשבים הכימי העברת גנים מחיידקי קרקע המקודדים לאנזימים מפרקים קוטל עשבים ( ניטרילאז, אציל-אמידאז , מונו אוקסיגנאז) או העברת גנים מצמחים עמידים המקודדים לאנזימים מפרקים או מבצעים שינוי כימי בקוטל העשבים ( אוקסידזות , אמידזות , דקרבוקסילזות ) (1) : ע"י בידוד גן מוטנטי המקנה עמידות לחלבון האנזים מצמח עמיד והעברתו לצמח רגיש. האנזים המוטנטי פועל גם בנוכחות החומר הכימי שקוטל את העשבים חסרון : סכנת ירידה בפעילות האנזים בגלל המוטציה (2) : ע"י חיבור פרומוטור חזק לגן האנזים הגורם להגברת כמות האנזים (ייצור-יתר) וייצור קונסטיטוטיבי וזה מקטין את אפקט העיכוב ע"י קוטל העשבים בשיטות אלה יצרו צמחים טרנסגנים עמידים לקוטלי עשבים : עגבנייה , תפוח אדמה , טבק. גן העמידות לקוטלי עשבים יכול לשמש סמן ברירה ( חלופי לעמידות לאנטיביוטיקה ) • עשבים שוטים מקטינים יצרנות חקלאית ולכן נלחמים בהם ע"י קוטלי עשבים כימיים שהם חומרים : • לא רעילים לבע"ח • מתפרקים ע"י חיידקים • זולים • יעילותם גבוהה • אך רעילים לצמחים ( בררנות נמוכה ) – לכן יש צורך בהקניית עמידות להדברה הכימית . 67

26. הקניית עמידות (ביולוגית) לחרקים מזיקים ע"י הנדסה גנטית במטרה לצמצם את השימוש בהדברה כימית ע"י החדרת גנים המקודדים לחלבון טבעי קוטל חרקים לצמחים רגישים ויצירת צמחים טרנסגנים עמידים לחרקים המורישים תכונה זו לצאצאים • בידוד גנים מחיידקים המקודדים • לחלבונים רעלנים (אנדו טוקסינים) • המתפרקים במעי החרק הניזון מהצמח • והופכים לפעילים ע"י פרוטאזות ב PH בסיסי • וגורמים להרס מעי זחל החרק • בידוד גנים מצמחים עמידים טבעית לחרקים • המקודדים לחלבונים המעכבים פעילות פרוטאזות ספציפיות • גורמים להפרעה בעיכול חלבוני הצמח במעי החרק ולמחסור • בחומצות אמיניות . • יתרון : טווח פעילות רחב נגד קשת רחבה של חרקים • חסרון: צריך כמות גדולה של המעכב כדי להמית את החרק • חלבוני העמידות : • מקודדים ע"י גן יחיד • אינם רעילים לאדם ובע"ח • קוטלים יעילים של חרקים אוכלי צמחים • פועלים במעי הזחלים של חרקים הצליחו לייצר צמחי טבק טרנסגנים המייצרים מעכבים לפרוטאזות של החרקים המזיקים והעמידים לחרקים • חסרונות הדברה כימית של חרקים : • נזק בריאותי לבע"ח ואדם • נזק סביבתי של זיהום מים קרקע ואוויר • חוסר יעילות בהגנה על הצמחים (יעילותו מוגבלת • לתקופות מסוימות של השנה ולחלקים מסוימים בצמח ) כיום יש תפוחי אדמה עגבנייה טבק כותנה טרנסגנים המייצרים חלבוני עמידות לחרקים במשך כל חייהם ומורישים תכונה זו לצאצאים דרך הזרעים 68

27. הקניית עמידות לצמחים נגד וירוסים ע"י הדבקת הצמח בנגיף מתון מקנים עמידות להתקפה של נגיף אלים. או ע"י החדרת גן לחלבון המעטפת הנגיפית והקניית " חיסון פעיל " ( המנגנון לא ברור ) • דוגמה : • בידודו הגן המקודד לחלבון המעטפת של נגיף TMV (נגיף מחלת המוזאיקה בצמחי טבק ) • מהנגיף • החדירו אותו לתאי צמח הטבק ליצירת צמחים טרנסגנים. • שוחזרו צמחי טבק טרנסגנים העמידים להתקפת הנגיף TMV בצמחי טבק . צמח עמיד לוירוסים צמח רגיש לוירוסים 69 http://www.tari.gov.tw/ARI_E/Introduction_PPD.htm

28. העשרה הדבקת צמח בחיידק אגרובקטריום נושא פלסמיד Ti http://www.nature.com/nature/journal/v433/n7026/fig_tab/433583a_F2.html 70

29. העשרה מבנה מפורט של הפלסמיד Ti http://www.fsbio-hannover.de/oftheweek/113.htm 71

30. העשרה החדרה ישירה לפרוטופלסטים 72 http://www.umanitoba.ca/afs/plant_science/COURSES/39-768/l04/l04.4.html

31. העשרה החדרת גנים באמצעות אקדח גנים Direct DNA Transfer http://www.umanitoba.ca/afs/plant_science/COURSES/39-768/l04/BioRad/genegun.html 73

32. העשרה החדרת גנים באמצעות תותח גנים Direct DNA Transfer תותח יורה גנים http://www.umanitoba.ca/afs/plant_science/COURSES/39-768/l04/BioRad/biolistics.html 74

33. העשרה חיידק BT - מייצר רעלן ההורג זחלים של חרקים מזיקים ( Bt toxin) חיידק BT(Bacillus thuringiensis) : חיידק קרקע אנאירובי , גרם חיובי , יוצר נבגים פנימיים בתוך התא. בזמן יצירת הנבג התוך-תאי נוצרים גביש חלבון הרעלן בתא החיידק המקודדים ע"י גנים היושבים על פלסמיד. תא החיידק עובר ליזיס . הספורות וגבישי החלבון משתחררים החוצה. http://www.bio.ic.ac.uk/research/djwright/images/gif/fig1.gif http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/bt.htm גבישים של חלבון הרעלן במצב לא פעיל http://www.ippc.orst.edu/dir/microbial/bt/ 75

34. העשרה • הרעלן נוצר כפרו-טוקסין לא פעיל : חלבון גדול בלתי מסיס משקלו המולקולארי 230 KD הנקרא Cry Toxin • הפרו -טוקסין מתמוסס בתנאים של PH גבוה 9.5 וכדי להיות פעיל צריך גם לעבור חיתוך ע"י אנזים פרוטיאז. • הטוקסין הפעיל קטן יותר ומשקלו המולקולארי נמוך יותר 65 KD . • פוטנציאל פעילותו חזק. פעיל בריכוזים של פיקו- מול. • פועל רק בתוך מעי זחלים שיש שם PH מתאים ופעילות פרוטאזות. שם מתמוסס ועובר הפעלה. • בתנאים רגילים הגבישים לא מתמוססים ולא עוברים הפעלה. לכן אינו מזיק לאדם ולבע"ח או לחרקים בוגרים. • שלבים בפעולת הרעלן במעי הזחלים : • הזחלים בולעים חיידקים ומעכלים את הספורות. • גבישי הפרו-טוקסין מתמוססים ב PH הגבוה שבמעי הזחל ועוברים חיתוך ע"י פרוטיאז. • הפרו-טוקסין עובר הפעלה לטוקסין הנקרא דלתא- אנדוטוקסין • הטוקסין נקשר לתאי אפיתל המעי של הזחל ויוצר חורים ותעלות בקרום התאים . תאי אפיתל המעי נהרסים ומערכת העיכול משותקת . • הספורות מתפתחות ויש זיהום חיידקי בקיבה • הזחל מת מרעב ומזיהום. http://www.doae.go.th/pest/cpv/bic22.jpg • היום יש צמחים טרנסגניםעמידים לחרקים ומכילים את הגן לרעלן ה Bt : • Bt cotton • Bt soybean • Bt potato http://www.nal.usda.gov/bic/BTTOX/bttoxin.htm 76

35. העשרה המנגנון שבו רעלן ה BT הורג זחלים של חרקים מזיקים http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/v217eh02.gif 77

36. העשרה שימוש בצמחים מהונדסים להפקת חלבונים רקומביננטים http://www.nature.com/nbt/journal/v22/n11/fig_tab/nbt1027_F1.html 78

37. סיכום השימושים השונים בתרביות צמחים קטע רקמת עלה תא סומאטי בוגר של רקמה תא סטם צעיר של רקמה שחזור וריבוי צמח שלם ביוטכנולוגיה חקלאית תאים בודדים במצב פרוטופלסט ע"י טיפול בצלולאז ופקטינאז תרבית קאלוס על מצע מוצק = צבר תאים לא ממוינים טלטול במצע נוזלי ע"י הרחפה וטלטול עדין למטרות טלטול במצע נוזלי תרבית תאי צמח במצע נוזלי (תרחיף תאים) הנדסה גנטית בידוד גנים החדרת גנים איחוי עם ספרופלסטים מחקר מקביל לתסיסה ביו טכנולוגית ייצור תעשייתי של ביו כימיקלים רקמה עוברית משמשת רקמת מוצא רקמה סומאטית משמשת רקמת מוצא 79

38. העשרה רשימת אתרים להרחבה ולהעמקה טרנספורמציה גנטית בצמחים http://www.wtcc.wur.nl/uk/Technologies/Transformation.htm שיטות החדרת גנים לצמחים http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/genetransfer.html http://www.shef.ac.uk/safety/genereg/gmos.html הכלאה סומאטית http://www.wtcc.wur.nl/uk/Technologies/Somatic+hybridisation.htm הנדסה גנטית בצמחים באמצעות חיידק אגרובקטריום http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/34.htm http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/34a.htm על החיידק אגרובקטריום http://en.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium_tumefaciens הנדסה גנטית של צמחים באמצעות נגיפים צמחיים http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e35/35b.htm גנים מדווחים http://www.umanitoba.ca/afs/plant_science/COURSES/39-768/l04/l04.1.html השיטה להכנת צמח טרנסגני http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/how.html http://www.ag.uiuc.edu/~vista/html_pubs/irspsm91/transfor.html 80

39. העשרה שימוש בחיידק אגרובקטריום להנדסת צמחים http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2009 http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2010 שימוש בצמחים מהונדסים ליצירת חלבונים רקומביננטיים http://www.nature.com/nbt/journal/v22/n11/fig_tab/nbt1027_F1.html עמידות צמחים טרנסגניים לחרקים http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2015 http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2016 חיידק BT http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/bt.htm#Top http://www.ippc.orst.edu/dir/microbial/bt צמחים מהונדסים עמידים לנגיפים http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2020 http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2021 צמחים מהונדסים עמידים לתנאי סטרס ( עקה ) סביבתיים http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2022 האם מזון מהונדס בטוח ? http://www.pueblo.gsa.gov/cic_text/food/bio-engineer/food.html 81

40. העשרה • אנימציות בהנדסה גנטית של צמחים: • אנימציה של יצירת צמח טרנסגני • http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/animation.html • אנימציה של שימוש בחיידק אגרובקטריום • http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/animations/Leaf%20Disk%20Animation/leafdisk1.html • אנימציה של יצירת צמח טרנסגני ע"י החיידק אגרובקטריום • http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/lecture%2009 • אנימציה של שימוש באקדח יורה גנים • http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT250/animations/Gene%20Gun%20Animation/Genegun1.html 82