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関節リウマチ関連遺伝子 PADI4 と シトルリン・抗シトルリン化ペプチド抗体 ～最近の話題～

関節リウマチ関連遺伝子 PADI4 と シトルリン・抗シトルリン化ペプチド抗体 ～最近の話題～. 平成 18 年 3 月 23 日 東京女子医科大学附属 膠原病リウマチ痛風センター 京都大学大学院医学研究科附属ゲノム医学センター 理化学研究所遺伝子多型研究センター 関節リウマチ関連遺伝子研究チーム 山田　亮. 項目. シトルリン・ PADI ・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項 遺伝子 アレル差解析 ( 関連解析 ) PADI ・シトルリン・シトルリン化 発現解析 酵素特性解析 基質解析 シトルリン化タンパク質解析

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関節リウマチ関連遺伝子 PADI4 と シトルリン・抗シトルリン化ペプチド抗体 ～最近の話題～

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Presentation Transcript

  1. 関節リウマチ関連遺伝子 PADI4 とシトルリン・抗シトルリン化ペプチド抗体～最近の話題～ 平成18年3月23日 東京女子医科大学附属 膠原病リウマチ痛風センター 京都大学大学院医学研究科附属ゲノム医学センター 理化学研究所遺伝子多型研究センター 関節リウマチ関連遺伝子研究チーム 山田　亮

  2. 項目 • シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項 • 遺伝子 • アレル差解析(関連解析) • PADI・シトルリン・シトルリン化 • 発現解析 • 酵素特性解析 • 基質解析 • シトルリン化タンパク質解析 • PADI・シトルリン化タンパクの病理 • 関節リウマチ • その他の疾患 • 動物モデル

  3. ？

  4. ？ 遺伝子アレル差解析

  5. ？ 発現解析

  6. ？ 酵素特性解析

  7. ？ 基質解析

  8. ？ シトルリン化タンパク質解析

  9. ？ シトルリン化タンパク質と 自己免疫反応関係の解析

  10. ？ 抗シトルリン化ペプチド抗体解析

  11. ？ 抗シトルリン化ペプチド抗体と関節炎・関節リウマチとの因果関係

  12. ？ 動物モデル解析

  13. 項目 • シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー • 遺伝子 • アレル差解析(関連解析) • PADI・シトルリン・シトルリン化 • 発現解析 • 酵素特性解析 • 基質解析 • シトルリン化タンパク質解析 • PADI・シトルリン化タンパクの病理 • 関節リウマチ • その他の疾患 • 動物モデルの視点からのサマリー

  14. フリーアミノ酸としての出納と代謝 アルギニン シトルリン

  15. NOS、NO産生 アミノ酸代謝 尿素サイクル

  16. コーディングアミノ酸　：　20種 必須アミノ酸　：　 ヒト9種 （＋準必須アミノ酸 3 種(Arg,His,Tyr)) ラット10種(ヒト＋アルギニン) シトルリン 対応tRNAなし 非コーディングアミノ酸

  17. ？ ペプチジルシトルリン化とその代謝サイクル 遊離アミノ酸 抗原提示 ペプチド化 分解と抗原処理 ？ シトルリン化タンパク PADI基質 ペプチジルシトルリン化

  18. アミノ酸の翻訳後修飾としてのシトルリン化 • リン酸化 • メチル化 • 水酸化 • アセチル化 • カルボキシル化 • シトルリン化 • グリコシル化 分子内反応関連 周辺残基影響 残基特異性

  19. 翻訳後修飾間関連 メチル化・シトルリン化相互作用 翻訳後修飾間相互作用メチル化・アセチル化・シトルリン化 メチル メチル メチル

  20. 項目 • シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー • 遺伝子 • アレル差解析(関連解析) • PADI・シトルリン・シトルリン化 • 発現解析 • 酵素特性解析 • 基質解析 • シトルリン化タンパク質解析 • PADI・シトルリン化タンパクの病理 • 関節リウマチ • その他の疾患 • 動物モデルの視点からのサマリー

  21. ？ 遺伝子アレル差解析

  22. Korean

  23. exons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SNPs PADI4 gene structure and association-positive SNPs EXONs SNPs Caucasians Japanese

  24. K562細胞におけるmRNA安定性解析 Vector : pcDNA-DEST40 CMV promoter PADI4 (susceptible and non susceptible type cDNA) 5’UTR 25bp 3’ UTR 218bp 実験方法 K562細胞にTransfectionし、48時間培養後、 5ug/ml actinomycin D処理 し、RNAを回収、TaqMan assayによりPADI4 RNA量を測定する。18S rRNA (細胞数), Neomycin遺伝子(transfection効率）を用いて補正を行った。 S: susceptible type N: non-susceptible type 100 * Ratio of gradiation (%) 50 * p<0.05 (t-test) S N S N S N 0h 2h 4h

  25. PADI4におけるRA関連ハプロタイプと非関連ハプロタイプ のアレル別発現量比較 Standard curve サンプルＤＮＡ, cDNA: PADI4遺伝子上padi4_89 (A/G)をヘテロ接合体でもつ健常人４人の末梢血リンパ球から精製したgenomic DNAとRNA Probe: Padi4_89 (A/G) genotyping用TaqMan probe Ratio of G: A alleles Ave. genomic DNA: 0.99 Ave. cDNA (4samples): 1.26 ＲＡ関連ハプロタイプは非関連ハプロタイプと比較して、ゲノムの場合は１なのに対して、cDNAでは平均１．３となっている。

  26. アレル差解析　まとめ • PADI4多型とRA発病リスクは • アジアン＞コーカシアン • 発病リスク多型は • コーディングSNPｓ / イントロンSNPs

  27. 項目 • シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー • 遺伝子 • アレル差解析(関連解析) • PADI・シトルリン・シトルリン化 • 発現解析 • 酵素特性解析 • 基質解析 • シトルリン化タンパク質解析 • PADI・シトルリン化タンパクの病理 • 関節リウマチ • その他の疾患 • 動物モデルの視点からのサマリー

  28. PADI酵素反応 • 発現・局在レベルの特異性 • 発現している臓器・組織・細胞内外・細胞内部位による特異性 • 反応環境による特異性(Ca2+など) • 基質特異性 • 残基特異性 • 残基修飾状態特異性

  29. PADIアイソザイム種間保存？生理的役割分担？PADIアイソザイム種間保存？生理的役割分担？

  30. 発現特異性 PADIアイソザイムの臓器・組織・細胞分布

  31. [Ca 2+]～10-3M Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005 反応環境特異性 [Ca 2+]によるPADI活性制御 細胞外・細胞内核外・核内 [Ca 2+]～10-7M

  32. 発現・活性化調節 monocytes and macrophages Macrophage Monocyte Transcriptional regulation Enzyme RNA DNA RNA DNA Enzyme PADI4 Enzyme-activational regulation Translational regulation PADI2 ER Vossenaar WJ vanVenrooij LAB Joosten et al. Arthritis & Rheum 2004

  33. Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005 基質特異性

  34. Nature Structural & Molecular Biology11, 777 - 783 (2004) Published online: 11 July 2004; | doi:10.1038/nsmb799 Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 327; 192-200:2005 残基特異性

  35. 残基修飾状態特異性 モノメチルArg メチル s-ジメチルArg a-ジメチルArg メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル メチル

  36. ？PADIの生理機能？ 翻訳後修飾 リン酸化、グリコシル化、アセチル化、ヒドロキル化、シトルリン化 両方向性反応・逆方向酵素ペア 修飾のON・OFF機能 リン酸化 キナーゼ⇔フォスファターゼ アセチル化 アセチラーゼ⇔デアセチラーゼ メチル化 PRMT⇔？デイミナーゼ？

  37. 翻訳後修飾間関連 メチル化・シトルリン化相互作用 ヒストンのメチル化・シトルリン化の場合 Arg と メチルArg はシトルリン化される ジメチルArg はシトルリン化されない メチル メチル メチル 少なくとも単純なON-OFF機構ではない ？シトルリン→アルギニン酵素の存在の有無？

  38. シトルリン化ヒストンのサルベージ(仮説)

  39. メチル化とシトルリン化が知られる基質 Histone Sm(Small nuclear ribonucleoproteins) Autoantigen

  40. Fibrinogen citrullination inhibits thrombin-catalyzed fibrin polymerization. Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al. ATIII was inactivated by citrullination and citrullinated fraction of ATIII was higher in RA plasma. Chang X, Yamada R, Yamamot K et al. Rheumatology 44:238-9;2005 その他基質 • Fibrinogenと重合性 • ATIIIとその活性 • Myelin Basic Protein(MBP)と脱髄

  41. MBPシトルリン化、シトルリン化残基特性についても知見あり(1970年代より2005年まで)MBPシトルリン化、シトルリン化残基特性についても知見あり(1970年代より2005年まで)

  42. 遊離アミノ酸・ペプチド・PADI酵素の細胞・細胞内器官別分布の解析遊離アミノ酸・ペプチド・PADI酵素の細胞・細胞内器官別分布の解析 抗原提示細胞による処理を経て自己免疫反応成立の可能性？ 生理的処理 アポトーシスを含めて？

  43. 存在・局在確認のためのシトルリン・PADIの解析抗体など存在・局在確認のためのシトルリン・PADIの解析抗体など RA３抗体はRA患者のB細胞を取ってきて、ｓｃFv（抗体の可変領域）をファージベクターに組み込みます。ファージの表面に発現したｓｃFvは抗体の種類だけ存在していることになり、RA患者由来のライブラリでは自己抗体もクローニングされます。ただし、その抗体の抗原が特定のタンパクのみを認識しているかどうかは不明であり、そのほかの様々なタンパクとクロスリアクションしている可能性が実験的にも示唆されています。

  44. PADI4反応産物

  45. 項目 • シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体に関する基礎事項オーバービュー • 遺伝子 • アレル差解析(関連解析) • PADI・シトルリン・シトルリン化 • 発現解析 • 酵素特性解析 • 基質解析 • シトルリン化タンパク質解析 • PADI・シトルリン化タンパクの病理 • 関節リウマチ • その他の疾患 • 動物モデルの視点からのサマリー

  46. 抗CCP抗体の局所産生 RA滑膜シトルリン化蛋白の存在 抗CCP抗体の特異性 破壊性亜型との関連 抗CCP抗体の発病前出現 ~9年 発病予測性 非RA（OA・Reactive arthritis)での シトルリン化蛋白の存在 抗CCP抗体産生B細胞の局所存在

  47. HLA・TCRとシトルリン化ペプチドの関係

  48. Augmentation of T-cell response by citrullinated peptides J.Hill E Cairns et al. J Immunol 2003

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