Molekulārās metodes mikrobioloģijā

1. Molekulārās metodes mikrobioloģijā Teorija 1. Genomiskās DNS izdalīšana 2012./2013. mācību gada 2. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Lielmolekulāras DNS izdalīšana 1. Bioloģiskā materiāla iegūšana. 2. Audu dezintegrēšana - parasti mehāniska. 3. Šūnu noārdīšana (lizēšana) - mehāniska, ķīmiska. 4. DNS attīrīšana no citiem savienojumiem. 5. DNS izgulsnēšana un šķīdināšana. 6. DNS papildus attīrīšana. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Cik daudz materiāla vajag ? Vienā diploīdā cilvēka šūnā - 6,6 pg (6,6x10-12g) DNS Vienā E. coli šūnā - 5,0 fg (5,0x10-15g) DNS Lai iegūtu 50 mg DNS, vajadzētu: ~107 cilvēka šūnu (apmēram, 1 - 2 ml asiņu) ~1010E. coli šūnu (apmēram, 2 ml tipiskas E. coli naktskultūras, kas atbilst ~ 6 mg mitro nogulšņu) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Cik daudz materiāla vajag ? Reālais DNS iznākums parasti mazāks, piemēram: ~2 mg DNS no 1 g zīdītājdzīvnieku audiem, 10 - 40 mg DNS no 1 g augu materiāla, 5 - 20 mg DNS no 1 ml baktēriju kultūras ~20 mg DNS no 1 ml cilvēka asiņu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Bioloģiskā materiāla iegūšana • Der jebkuras šūnas un audi, kuros atrodas DNS. - zīdītāju eritrocīti un trombocīti ir bez kodoliem. • Jāraugās, lai materiāls būtu tīrs, bez citu organismu vai DNS piesārņojuma. • No piesārņojuma jāuzmanās arī DNS izdalīšanas laikā, - reaģenti nedrīkst būtu piesārņoti ar mikroorganismiem vai citu DNS. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana. Blīvas daudzšūnu struktūras sadala pēc iespējas mazākos gabalos, lai uzlabotu lizējošo šķīdumu piekļuvi materiālam un palielinātu to iedarbības virsmu. Nav nepieciešama materiāliem atsevišķu šūnu formā: - baktēriju, raugu kultūras, - eikariotu šūnu kultūras, - asinis, - sperma, amniocīti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana. Strādājot ar audiem, - īpaši ar augu materiālu, homogenizācija ir nepieciešama. Izmanto - gaļas mašīnas, - dzirnavas; LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana. Sasaldē un homogenizē - piestā, - speciālos vibrohomogenizātoros, - koloidālajās lodīšu dzirnavās. Var iesaldētus audus homogenizēt ar āmuru. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana. Daži materiālu veidi viegli sagraujami beržot piestā. Materiālu parasti iesaldē ar šķidru slāpekli un saberž smalkā pulverī. Efektivitāti palielina pievienotas: - kvarca smiltis, - stikla pulveris, - alumīnija oksīda pulveris. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Nažu dzirnavas. Materiāls tiek samalts ar rotējošiem nažiem. Lieto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Dounča homogenizators. (Dounce homogenizer) Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli. Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Potera homogenizators. (Potter [Elvehjem ]homogenizer) Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli. Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Lodīšu dzirnavas. Materiāls tiek samalts ar lodītēm vibrējošā kapsulā. Materiālu parasti iesaldē. Lieto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija). Straujās svārstības vidē veiksmīgi iedarbojas uz šūnām un audu gabaliņiem, radot spēcīgu nobīdes deformāciju. Jāuzmanās no pārmērīgas parauga sasilšanas un putošanās - veic ledus vannā. Šūnu un audu suspensijā, notiek arī DNS fragmentācija. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Frenča presse. (French Press) Šūnas ar lielu spiedienu tiek dzītas cauri ļoti smalkai sprauslai. Pielieto mikroorganismiem ar šūnapvalku (baktērijas, aļģes, raugi) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Homogenizēšana ar stikla daļiņām. Materiālu vorteksē kopā ar stikla daļiņām. Lieto audu kultūru, baktēriju suspensijām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. DNSkvanti-tēšana LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. DNS koncentrācijas noteikšana Izdalītajai un attīrītajai DNS vēlams noteikt koncentrāciju. To dara spektrofotometriski, nosakot absorbciju pie 260 nm. 1 OD vienība atbilst ~50 mg/ml divpavedienu DNS. (l=1cm) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. DNS tīrības pārbaude DNS preparāta tīrību var pārbaudīt mērot absorbciju pie 280 nm. Tīrai DNS - OD260/OD280 = 1,8 (1,75) Proteīnu piemaisījumi vai fenola paliekas šo vērtību samazina. RNS - palielina. (tīrai RNS - OD260/OD280 = 2.0). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. DNS tīrības pārbaude Peptīdsaites Aminoskābju aromātiskās sānu grupas LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. DNS tīrības pārbaude Ja paraugā ir proteīnu, RNS u.c. piemaisījumi - kvantitēšana pēc OD260 var izrādīties visai neprecīza. Ja DNS preparātā ir neliels proteīnu piejaukums, var mērīt arī absorbciju pie 230 nm. OD260/OD230 < 1.5 norāda uz proteīnu (peptīdsaite) un citu organisku vai neorganisku vielu piesārņojumu paraugā. (normāli vērtībai jābūt 2.0 - 3.0) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. DNS kvalitātes pārbaude DNS preparātu analizē elektroforētiski - pārbauda, kāds ir raksturīgais DNS fragmentu lielums, salīdzinot ar DNS fragmentu garuma standartiem. Parastā agarozes elektroforēzē var atdalīt DNS fragmentus līdz 16 000 bp. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. DNS kvalitātes pārbaude Arī lielākie DNS fragmenti migrē kopā ar 16 kb zonu. Garākus fragmentus (līdz 10 Mb) var izšķirt ar pulsējošā lauka gelelektroforēzi (PFGE). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. DNS kvalitātes pārbaude Liela izmēra dpDNS fragmenti (> 16 000 bp) RNS LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. DNS kvalitātes pārbaude Daļēji hidrolizēta DNS Stipri hidrolizēta DNS LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. Šūnu lizēšana Lizēšanas buferos parasti ietver: Tris - HCl 10 - 100 mM pH 6,5 - 8,0 Savienojums bufersistēmu veidošanai, lai uzturētu noteiktu pH. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. 2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Tris-bāze LD50 / orāli / žurkai = 5 900 mg/kg kairina ādu, gļotādas Xi Sintētiska viela (~1940) ar bāziskām īpašībām (pH ~ 10,5) Tris(hidroksimetil)aminometāns; Trometamīns; Trizma u.c. C4H11NO3 (HOCH2)3CNH2 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. 2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Tris-bāze H+ Plaši izmanto bufersistēmu pagatavošanai, (1955) pH 6,5 - 8,5 titrējot ar dažādām skābēm, visbiežāk HCl => Tris - HCl Bieži lietotās pH vērtības: 6,7 7,0 7,5 8,0 Gatavo 2M izejas šķīdumu ar vajadzīgo pH LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. 2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Tris-bāze Elektroforēzei bieži izmanto: Tris - borāta (borskābe) Tris - acetāta (etiķskābe) Tris - glicīna Tris - alanīna (aminoskābes) bufersistēmas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. Šūnu lizēšana Lizēšanas buferos tāpat kā daudzos citos šķīdumos darbam ar nukleīnskābēm parasti ietver: EDTA 10 - 100 mM koncentrācijā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. Etilendiamīn- tetraetiķskābe EDTA EDTA - Etilēndiamīn-N,N,N',N'-tetraetiķskābe C10H16N2O8 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. EDTA Etilendiamīn- tetraetiķskābe LD50 / orāli / žurkai = 2 200 mg/kg Sintētiska viela (~1935) ar maz izteiktām skābes īpašībām. EDTA skābes formai maza šķīdība ūdenī (~0,5g/l), tādēļ parasti lieto tās sāļus ar vienvērtīgajiem katjoniem. Visbiežāk izmanto dinātrijasāli (Na2EDTA), kura ūdenī šķīst daudz labāk. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. EDTA EDTA Savienojums labi saista divvērtīgo metālu jonus (Ca++, Mg++), kuri nepieciešami nukleāžu un citu hidrolītisko enzīmu aktivitātei. Pievieno arī asins paraugiem uzglabāšanas laikā kā pretrecēšanas līdzekli, jo tas saista asins recēšanai nepieciešamos Ca++ jonus (EDTA vakutaineri). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. EDTA Laboratorijas vajadzībām gatavo 0,5M izejas šķīdumu. Lai viela pilnībā izšķīstu, ar NaOH šķīdumu titrē līdz pH 8,0 Darba šķīdumos EDTA koncentrācija parasti 1 - 100 mM LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. EDTA Plašāks pielietojums - kā ūdens mīkstinātājs un dažādu daudzvērtīgo metālu jonu helators rūpnieciskajos un ūdens attīrīšanas procesos; EDTA sāļi arī kā pārtikas piede- va - stabilizators (E385; E386); Medicīnā kā pretinde saindējo- ties ar smago metālu sāļiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Šūnu lizēšana Lizēšanas vai ķīmiskās noārdīšanas procesu pamatā veic ar jonisko deterģentu palīdzību. Bieži tiek izmantots ~ 0,5% SDS (beigu koncentrācija darba šķīdumā). ! ! ! Pievieno, kad šūnas labi izjauktas lizēšanas buferī. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. Nātrija dodecilsulfāts SDS LD50 / orāli / žurkai = 1 288 mg/kg kairina ādu, gļotādasXi NaC12H25SO4 Nātrija laurilsulfāts SLS (sadzīves ķīmijā) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. SDS Pussintētiska viela, ko pamatāiegūst no eļļas palmu augļu un kokosriekstu eļļas (bagātas ar laurilskābi). Ūdens šķīdumiem bāziskas īpašības (pH 9-10). SDS Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloidālas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām un hidrofobām vielām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. SDS Pielietojums: - Audu un šūnu ķīmiska noārdīšana (P., nukleīnskābju izdalīšana), - Proteīnu denaturēšana gelelektroforēzē, (~1 SDS molekula uz 2 aminoskābju atlikumiem) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. SDS SDS Gatavo 10% izejas šķīdumu ūdenī. Uzglabā istabas temperatūrā, lai SDS nekristalizētos un šķīdums "nesasaltu". SDS kā deterģents plaši tiek lietots arī sadzīves ķīmijā: - šampūni, - tehniskie mazgāšanas līdzekļi, - šķidrās ziepes. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. Šūnu lizēšana Lizēšanas gaitā nereti tiek izmantota materiāla apstrāde ar : Proteināzi K Proteolītisks enzīms. Aktivitāti iespējams divkāršot paaugstinot temperatūru no 37°C => 50° - 60°C virs 65°C sākas strauja enzīma denaturācija. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. Šūnu lizēšana EC 3.4.21.64 Proteināze K Optimālais pH: 7.5 - 12.0 Aktivitātei netraucē denaturējoši aģenti: - SDS 0,5 - 1,0 %, - urīnviela 1 - 4 M. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. Šūnu lizēšana Proteināzes K Aktivitātei netraucē : - jonu helatori (EDTA) (enzīmam vēlami Ca+ joni, bet tā stabilitātei, ne aktivitātei); - tripsīna un himotripsīna inhibitori. Enzīmu iespējams izmantot apstākļos, kad vairums šūnas enzīmu (nukleāžu) zaudējuši aktivitāti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. Šūnu lizēšana Proteināzi K iegūst no sēnes Tritirachium album līnijas Limber. Endoproteāze. Serīna proteāze. EC 3.4.21.64 Peptīdsaiti šķeļ karboksil grupas pusē no alifātiskajām, aromātiskajām vai hidrofobajām aminoskābēm. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48. Šūnu lizēšana Proteināzi K Parasti izmantotā beigu koncentrācija darba šķīdumos: 0,05 - 1,0 mg/ml Izejas šķīdumu koncentrācija 20 mg/ml vai 10 mg/ml, Šķīdina ūdenī vai uzglabāšanas buferī: 20mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM CaCl2 50 % glicerols Fasē un uzglabā mazos tilpumos - 20o C LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49. Šūnu lizēšana Proteināze K tiek izmantota arī šūnu struktūru noārdīšanai, lai labāk izdalītu to sastāvdaļas, piemēram, mitohondrijus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

50. Šūnu lizēšana Apstrādi ar Proteināzi K var papildināt vai aizstāt ar joniskā deterģenta CTAB klātbūtni. Tas ne tikai denaturē proteīnus, bet arī ar tā palīdzību iespējams izgulsnēt nukleīnskābes. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML