AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS ENDÓFITOS A PARTIR DE ESPONJAS MARINAS

1. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS ENDOFITOS A PARTIR DE ESPONJAS MARINAS PARA DEGRADACIÓN DE PESTICIDAS Docente: Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales Curso: Microbiología Ambiental Alumnos Kevin Dany Ayma Cuno Josephy Jorge Romero Cespedes Ciclo: VII Fecha: 29 de abril del 2025 ILO – PERÚ

2. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HONGOS ENDÓFITOS A PARTIR DE ESPONJAS MARINAS PARA LA DEGRADACIÓN DE PESTICIDAS Introducción La contaminación por pesticidas en los ecosistemas costeros es un desafío ambiental significativo debido a su persistencia y toxicidad, afectando tanto a los organismos marinos como a los humanos. En este contexto, el aislamiento y la caracterización de hongos endófitos presentes en esponjas marinas se presenta como una posible solución biológica para la degradación de estos contaminantes. Los hongos endófitos, conocidos por su capacidad para degradar compuestos tóxicos, podrían ser aliados clave en la mitigación de los efectos negativos de pesticidas como la atrazina, clorpirifos, imidacloprid entre otros. Este estudio en el curso de microbiología tiene como objetivo evaluar el potencial de estas cepas fúngicas para contribuir a la restauración de ecosistemas costeros contaminados. 1.OBJETIVO GENERAL Evaluar si el potencial de hongos endófitos aislados de esponjas marinas para la degradación de pesticidas presentes en ecosistemas costeros. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar y caracterizar si las cepas de hongos endófitos marinos con capacidad enzimática para degradar compuestos pesticidas como atrazina, clorpirifos e imidacloprid. Analizar si el efecto de la actividad metabólica de los hongos seleccionados en la reducción de la toxicidad y persistencia de pesticidas bajo condiciones ambientales simuladas. 2.INTERROGANTE GENERAL ¿Cómo puede el aislamiento y caracterización de hongos endófitos a partir de esponjas marinas contribuir a la degradación de pesticidas en ecosistemas costeros contaminados? INTERROGANTES ESPECIFICAS ¿Qué cepas de hongos endófitos presentes en esponjas marinas muestran mayor capacidad enzimática para degradar compuestos pesticidas como atrazina, clorpirifos o imidacloprid? ¿Cómo influye la actividad metabólica de los hongos endófitos marinos en la reducción de la toxicidad y persistencia de pesticidas en condiciones ambientales simuladas?

3. 3.HIPÓTESIS GENERAL Los hongos endófitos aislados de esponjas marinas poseen capacidad enzimática y metabólica suficiente para degradar pesticidas presentes en ecosistemas costeros, contribuyendo así a la reducción de su toxicidad y persistencia ambiental. HIPÓTESIS ESPECIFICAS Existen cepas de hongos endófitos marinos capaces de degradar eficientemente compuestos pesticidas como atrazina, clorpirifos e imidacloprid mediante la producción de enzimas especializadas. La actividad metabólica de los hongos endófitos seleccionados reduce significativamente la toxicidad y concentración residual de pesticidas bajo condiciones ambientales simuladas. 4.METODOLOGÍA 1. Recolección de Muestras Se recolectara esponjas marinas saludables para analizar los hongos endófitos. Utilizamos cuchillos y recipientes estériles para recolectar muestras de esponjas marinas saludables en el ecosistema costero, de preferencia en diferentes zonas del ecosistema (por ejemplo, en áreas de marea alta y baja, diferentes profundidades, etc.). Colocamos las muestras en bolsas estériles y mantenlas en condiciones refrigeradas hasta llegar al laboratorio (máximo 4 horas después de la recolección). 2. Esterilización de Superficie Eliminar contaminantes superficiales sin afectar los hongos endófitos. Lava las esponjas con agua estéril para eliminar contaminantes solubles y partículas superficiales. Y se sumerge las esponjas en etanol al 70-75% durante 1-2 minutos. El etanol desinfectará la superficie sin afectar a los hongos internos. La cantidad de etanol dependerá del tamaño de las esponjas (aproximadamente 100 ml por esponja). Sumerge las esponjas en hipoclorito de sodio al 2% durante 1 minuto. Esta concentración de hipoclorito actúa como desinfectante adicional y es efectiva para eliminar bacterias y esporas superficiales de hongos. Enjuaga las esponjas 3 veces con agua destilada estéril para eliminar residuos de los agentes desinfectantes. Asegúrate de que el agua esté completamente libre de cloro para evitar toxicidad en los hongos internos. 3. Cultivo e Incubación de Hongos Endófitos Aislar y cultivar los hongos endófitos de las esponjas marinas.

4. Corta las esponjas en fragmentos pequeños con cuchillos estériles, de aproximadamente 1-2 cm. Es importante que los fragmentos sean lo suficientemente pequeños para que se maximice la superficie disponible para el crecimiento fúngico. Coloca los fragmentos de esponja sobre placas de Petri con medio de cultivo adecuado para hongos marinos. El medio más utilizado es el PDA (Potato Dextrose Agar), que se prepara de la siguiente forma: Preparación del medio PDA: Ingredientes: 200 g de papa (para obtener extracto de papa) 20 g de dextrosa (para proveer fuente de carbono) 15 g de agar-agar (como agente solidificante) 1 L de agua destilada estéril Procedimiento: Cocina las papas en 1 L de agua para obtener el extracto, luego filtra el extracto. Disuelve la dextrosa y el agar-agar en el extracto filtrado. Esteiliza la mezcla en autoclave a 121 °C por 20 minutos. Vierte el medio caliente en placas de Petri estériles y deja solidificar. También se puede usar MEA (Malt Extract Agar) si buscas un medio más específico para hongos marinos. Incuba las placas a 25–28 °C durante 7-14 días. Este rango de temperatura es ideal para el crecimiento de hongos endófitos marinos, pero se recomienda observar las placas diariamente. Si hay diferentes especies de esponjas, se puede dividir las esponjas en grupos para incubarlas en diferentes condiciones de temperatura o humedad relativa, si se cree que los hongos endófitos tienen requisitos específicos. Una vez que aparezcan colonias fúngicas, transfiérelas a nuevas placas con medio fresco para obtener cultivos puros. Usa una técnica de aislamiento en zona de crecimiento de la colonia para evitar contaminantes. 4. Almacenamiento y Crecimiento del Hongo Obtenemos la biomasa suficiente para pruebas posteriores, como la degradación de pesticidas. Después de obtener cultivos puros, transfiérelos a frascos con medio líquido adecuado. Un medio comúnmente utilizado es YPD (Yeast Peptone Dextrose): Preparación de YPD: Ingredientes:

5. 10 g de extracto de levadura 20 g de peptonas 20 g de dextrosa 1 L de agua destilada estéril Esteriliza en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Incuba los frascos con el medio líquido en un shaker a 25–28 °C y agita a 200-250 rpm durante 7-14 días. La agitación en el shaker favorece la aeración y el crecimiento de los hongos.La aeración de los hongos, al ser organismos vivos, necesitan oxígeno para su crecimiento. La agitación en el shaker mejora la oxigenación del medio líquido, asegurando que los hongos tengan suficiente aire (oxígeno) para desarrollarse correctamente, mientras que el movimiento continuo del shaker asegura que los nutrientes y otros componentes del medio de cultivo estén bien distribuidos, lo que permite que los hongos tengan acceso uniforme a lo que necesitan para crecer. Finalmente se filtra el medio después del cultivo para obtener la biomasa fúngica (micelio), la cual será utilizada en pruebas de actividad biológica o extracción de metabolitos. 5. Prueba de Degradación de Pesticidas Se evaluará la capacidad de los hongos endófitos para degradar pesticidas como atrazina o clorpirifos. Se prepara una solución de pesticida en el medio líquido adecuado. En el caso de utilizar atranzina o clorpirifos, disuélvelos en agua destilada estéril con la siguiente concentración final: Concentración recomendada: Atrazina: 5 y 10 mg/L (aunque puede ajustarse dependiendo de las concentraciones comunes en estudios previos). Clorpirifos: 5 y 10 mg/L. Se disuelve el pesticida en el medio líquido estéril y se asegura de que la concentración sea constante antes de agregar los hongos. Inocula los pesticidas en el medio con hongos (biomasa) Incuba el sistema durante 7-14 días a 25–28 °C. Asegúrate de que los hongos se desarrollen correctamente y que el pesticida no inhiba su crecimiento. Toma muestras al inicio y al final del período de incubación para medir la concentración de pesticidas. 6. Medición de pesticidas

6. Se usan técnicas como HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) para cuantificar la concentración de pesticidas. Es importante que se utilicen los mismos métodos de análisis que han sido validados en la literatura científica para obtener resultados confiables. Y se compara las concentraciones de pesticidas antes y después del cultivo para evaluar si ha ocurrido degradación. La presencia de una disminución significativa en la concentración de pesticidas indicará la actividad biorremediadora de los hongos. 7. Caracterización del hongo (Identificación molecular) Extrae el ADN del hongo. Usa PCR para amplificar la región ITS del ADN ribosomal. Envía la secuencia para análisis y compárala con bases de datos (BLAST – NCBI) para identificar la especie. 5.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Los pesticidas de uso actual (CUP) como clorpirifos, clortalonil e imidacloprid, junto con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), están contaminando zonas costeras y marinas, comprometiendo la salud humana y el equilibrio ecológico (Primost et al., 2024; Wang et al., 2025). La atrazina destaca como el pesticida más detectado en ambientes marinos (Zhao et al., 2025). Esta problemática surge del uso intensivo de pesticidas en la agricultura moderna, necesarios para evitar grandes pérdidas en cultivos y sostener la seguridad alimentaria global (Tudi et al., 2021). Aunque han sido clave en el crecimiento económico y el control de vectores (Rajak et al., 2023; Popp et al., 2013), su persistencia genera alteraciones microbianas que afectan los ciclos del carbono y nitrógeno (Wu et al., 2024; Sim et al., 2022), además de bioacumularse y biomagnificarse en la red trófica, con efectos tóxicos en organismos marinos y humanos (Borgaê et al., s.f.; Gul et al., 2025). 6.MARCO TEÓRICO Hongos endófitos marinos Los hongos endófitos son microorganismos que habitan en los tejidos de plantas, corales o esponjas, sin causarles daño directo. En los ecosistemas marinos, las esponjas son un hábitat rico para estos hongos, los cuales tienen un papel fundamental en las interacciones simbióticas y en la producción de compuestos bioactivos. Los hongos endófitos marinos han demostrado tener capacidades únicas para producir metabolitos secundarios que son útiles en diversas aplicaciones biotecnológicas, como la biodegradación de contaminantes (Vasconcelos, 2014). Aislamiento de hongos endófitos El aislamiento de hongos de esponjas marinas se realiza mediante técnicas de cultivo, que incluyen el uso de medios de cultivo selectivos y condiciones controladas de temperatura y salinidad y este proceso permite identificar las especies fúngicas y evaluar su potencial para producir metabolitos con actividades biológicas, como la degradación de pesticidas (Ortega et al., 2011; Caballero-George et al., 2010).

7. Capacidad de degradación de pesticidas Algunos hongos endófitos asociados a esponjas marinas han mostrado una notable capacidad para degradar compuestos tóxicos, incluidos pesticidas. Los hongos Trichoderma sp. y Penicillium sp., por ejemplo, han sido reportados como capaces de tolerar y degradar productos químicos como el DDD (diclorodifenildicloroetano)es un pesticida organoclorado (Vasconcelos, 2014; Ortega et al., 2011). Estas especies producen enzimas que descomponen los pesticidas, lo que hace posible su aplicación en la biorremediación de ambientes contaminados. 7.PRESUPUESTO Y CRONOGRAMA PRESUPUESTO Y CRONOGRAMA DE ACTVODADES : CONCEPTOS Materiales y reactivos Medios de cultivo (PDA, MEA) Kit de extracción de ADN Reactivos para PCR Estándares de pesticidas Material de vidrio (pipetas, etc.) Total Materiales Equipos y servicios Secuenciación (outsourcing) Alquiler de bote para colecta Pesticidas - - Total equipos/servicios MATERIALES UNIDADES 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 COSTO S/. S/. S/. S/. S/. S/. S/. 100 S/. 30 S/. S/. 160 Meses MAYO JUNIO JULIO 1.ACTIVIDADES 1 2 1 Semana 1 2 3 4 3 4 2 3 4 Revisión Bibliografica Revisión del Marco teórico Primer borrador del marco teórico Preparación del primer informe Colecta de esponjas marinas (salidas de campo) Aislamiento Ensayos de degradación de pesticidas Caracterización molecular (PCR, secuenciación) y bioquímica Análisis estadístico y redacción de resultados. Organización y redacción de los capítulos del proyecto Corrección Redacción Definitiva

8. Presentación definitiva

9. 8.REFERENCIAS Vasconcelos, M. (2015). Prospecção de fungos derivados de esponjas marinas na degradação/descoloração de poluentes ambientais... https://doi.org/10.11606/T.87.2015.tde- 31082015-141925 Ortega, S., Nitschke, M., Mouad, A., Landgraf, M., Rezende, M., Seleghim, M., Sette, L. y Porto, A. (2011). Aislamiento de hongos marinos brasileños capaces de crecer en el pesticida DDD. Biodegradación , 22, 43-50. https://doi.org/10.1007/s10532-010-9374-8 Anteneh, Y., Brown, M. y Franco, C. (2019). Caracterización de un hongo halotolerante de una esponja marina. BioMed Research International , 2019. https://doi.org/10.1155/2019/3456164 Primost, M. A., Chierichetti, M. A., Castaños, C., Bigatti, G., & Miglioranza, K. S. B. (2024). Persistent Organic Pollutants (POPs), Current Use Pesticides (CUPs) and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in edible marine invertebrates from a Patagonian harbor. Marine Pollution Bulletin, 207, 116940. https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2024.116940 Wang, L., Dai, A., Dai, Y., Lu, L., Li, X., Zhao, J., & Li, K. (2025). Comprehensive ecological risk assessment method for multi-pesticide pollution in the Bohai Sea and Yellow Sea, China. Marine Pollution Bulletin, 214, 117781. https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2025.117781 Zhao, J., Dai, Y., Wang, L., Lu, D., Cui, X., Lu, L., Zhang, J., Li, K., & Wang, X. (2025). Spatiotemporal distribution and fate of typical pesticides in the Bohai Sea and surrounding rivers, China. Environmental Pollution, 371, 125934. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2025.125934 Bertrand, J. C., Bonin, P., Caumette, P., Gattuso, J. P., Grégori, G., Guyoneaud, R., Le Roux, X., Matheron, R., & Poly, F. (2015). Biogeochemical Cycles. Environmental Microbiology: Fundamentals and Applications, 511–617. https://doi.org/10.1007/978-94-017-9118-2_14 Borgaê, K., Gabrielsen, G. W., & Skaare, J. U. (n.d.). Biomagni®cation of organochlorines along a Barents Sea food chain. www.elsevier.com/locate/envpol González, R., Durante, C., Arcagni, M., Juncos, R., Seco Pon, J., Crespo, E., & Narvarte, M. (2021). Effects of Pollution in Aquatic Food Chains. Anthropogenic Pollution of Aquatic Ecosystems, 61– 89. https://doi.org/10.1007/978-3-030-75602-4_4 Gul, S., Chashoo, H. F., Hanief, F., Abubakr, A., Malik, M. M., & Hamid, I. (2025). Pesticide Biomagnification: A Comprehensive Exploration of Environmental Dynamics and Human Health Implications. Food Security, Nutrition and Sustainability Through Aquaculture Technologies, 299–309. https://doi.org/10.1007/978-3-031-75830-0_16 Lykogianni, M., Bempelou, E., Karamaouna, F., & Aliferis, K. A. (2021). Do pesticides promote or hinder sustainability in agriculture? The challenge of sustainable use of pesticides in modern agriculture. In Science of the Total Environment (Vol. 795). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.148625 Mishra, A. K., Arya, R., Tyagi, R., Grover, D., Mishra, J., Vimal, S. R., Mishra, S., & Sharma, S. (2021). Non-Judicious Use of Pesticides Indicating Potential Threat to Sustainable Agriculture. 383–400. https://doi.org/10.1007/978-3-030-63249-6_14 Popp, J., Pető, K., & Nagy, J. (2013). Pesticide productivity and food security. A review. In Agronomy for Sustainable Development (Vol. 33, Issue 1, pp. 243–255). Springer-Verlag France. https://doi.org/10.1007/s13593-012-0105-x

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