第二十五章干细胞及其利用

第二十五章干细胞及其利用 医学细胞生物学与遗传学教研室

新闻 • 1、“万能的皮肤细胞”—— 皮肤细胞造精子皮肤细胞变“心脏” 皮肤细胞培育出神经元皮肤细胞培育出肝细胞 • 2、世界首例干细胞气管移植手术完成

皮肤细胞造精子 • 英国纽卡斯尔大学的科学家用皮肤干细胞首次制造出了人类精子。这对成千上万的不育男性来说无疑是个福音，也许只是从身上取下一小块皮肤，就可以让他们做父亲。 • 不过，这一尖端技术引起了医学和伦理上的争议，因为这意味着可以完全凭人工手段生孩子，甚至让死了很长一段时间的男子也可以做“父亲”。 • 用皮肤细胞制造精子的过程：先将这些细胞放入用特殊培养基中培养，使细胞的生物钟回到胚胎干细胞阶段，之后再转变成精子。最后，利用试管受精技术将这些人造精子注入卵子，使卵子受精，这样就可以让那些自身不能产精的男子有自己的孩子。

皮肤细胞变“心脏” • 新加坡国家心脏中心一组科研人员取得重大医学突破，他们通过无菌的方式，成功将人体皮肤改造成人类诱导多能干细胞，并培育出与普通心脏一样具有脉搏跳动功能的心肌细胞，希望以此为心脏衰竭病患提供多一种治疗方式。 • 由于皮肤组织来自于病患本身，改造后的细胞特性与体内细胞相同，因此在植入身体后，不必担心会产生排斥反应，也不需要用到免疫抑制药物。”

皮肤细胞培育出神经元 • 巴西里约热内卢联邦大学胚胎干细胞国家实验室的科研人员利用一种可诱导皮肤细胞去分化成多能干细胞的技术，在实验室里获得痴呆症患者的神经元。 • 目前，该技术可用来制作一种疾病的精确模型，通过诱导多能干细胞产生的神经细胞来复制疾病发生的条件，有助于科学家认识与治疗这类脑疾病。

皮肤细胞培育出肝细胞 • 剑桥大学的科学家利用肝病患者的皮肤小样本生成了患病的肝细胞。该发现第一次证实干细胞可以用于构建大量的遗传疾病模型，为肝病患者开发新的治疗方法创造了希望。 • 从七个各种遗传性肝病患者和三个健康个体（对照组）身上获取了皮肤活组织。然后他们将皮肤细胞重编程使之转变为干细胞。这些干细胞进而被用来生成模拟各种肝病的肝细胞。研究者第一次使用干细胞制造出了患者特异性的肝病模型，而从对照组获得的细胞则生成了“健康”的肝细胞。且研究者证实造模的三种疾病病理机制完全不同，证明了此研究有潜力被运用到各种病症中。

世界首例干细胞气管移植手术完成 • 日前，英国和意大利两国医生联合完成世界首例气管移植手术。这个手术的特别之处在于，植入患者体内的捐献者的气管已经被剥离掉细胞，只剩一个“架子”，而医生则将从患者体内提取的干细胞注入这个“架子”中。这样，最终长成后的气管就不会产生任何排异现象，从而攻克了气管移植手术抗排异难这一世界性难题。 • 据悉，利用这种气管手术的原理，医生们还可以移植声带和食道等组织。如果未来推广到全世界，将使万千病人解除病痛，从此可以轻松地生活。

第一节干细胞概述 概述 • 一、干细胞的概念 • 1、干细胞（stem cell）：是指具有无限或较长期的自我更新（self-renewal）能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。 • 它存在于人体或动物个体发育各个阶段的组织器官中，是各种分化细胞或特化细胞的初始来源。

第一节干细胞概述 概述 2、干细胞的分类 • 根据分化潜能的高低：全能干细胞多能干细胞单能干细胞 • 根据细胞来源时期不同: 胚胎干细胞成体干细胞

全能干细胞（totipotent stem cell）：能发育为一个完整个体的原始细胞。（受精卵、人体8-16细胞以前的卵裂球） • 多能干细胞（pluripotent stem cell）：来源于囊胚腔的内细胞团，失去发育为完整个体的能力，但理论上具有分化形成个体多种细胞的细胞。（胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、骨髓基质干细胞） • 单能干细胞（monopotent stem cell）：只能向密切相关的一种或少数几种类型的细胞分化的细胞。（上皮组织基底层的干细胞、肌肉中成肌细胞）。

胚胎干细胞(embryonic stem cell；ES cell)：存在于早期胚胎组织中、具有高度增殖能力和多向分化潜能，但尚未分化的干细胞。 • 成体干细胞（adult stem cell ）：存在于成体各组织器官的未分化细胞，在体内具有终生自我更新能力和分化潜能。

二、干细胞的生物学特性 （一）干细胞的形态和生化特征 1、形态特征 • 通常呈圆形或椭圆形，体积较小，核质比例相对较大。

二、干细胞的生物学特性 （一）干细胞的形态和生化特征 • 1、形态特征 • 2、生化特征干细胞都具有较高的端粒酶活性；不同的干细胞具有不同的生化标志。如：nestin为神经干细胞的标志分子；角蛋白15是确定毛囊中表皮干细胞的标志分子；CD34是造血干细胞的标志分子等等。干细胞的生化特性常被用作鉴定干细胞在组织中的存在和评价其分化程度的标志。

二、干细胞的生物学特性 • （二）干细胞的增殖特性 • 1、缓慢性 • 2、自稳性

干细胞 1、缓慢性干细胞自身的增殖非常缓慢。一般情况下，干细胞处于休眠或缓慢增殖状态，当其接受刺激而进行分化时，需产生过渡类型细胞再到分化细胞。意义: • ①有利于干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程序； • ②可以减少基因发生突变的危险，使干细胞有更多的时间发现和校正复制错误，具有防止体细胞自发突变的作用。

干细胞 1、缓慢性短暂增殖细胞干细胞自身的增殖非常缓慢。在干细胞到分化细胞的发育过程中，有两种过渡类型的细胞——短暂增殖细胞和祖细胞。祖细胞短暂增殖细胞：分裂速度快。意义：可使少量干细胞产生较多的分化细胞，同时保护干细胞。祖细胞：为前体细胞，经过几次分裂后，产生的细胞为终末分化细胞。

干细胞 2、自稳性短暂增殖细胞干细胞通过自我更新以维持自身数目恒定。是区别于肿瘤细胞的本质特征。祖细胞（1）对称分裂（symmetry division）：当干细胞分裂时，产生的2个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞．（2）不对称分裂（asymmetry division）：当干细胞分裂时，产生一个子代干细胞和一个子代分化细胞．

2、自稳性 在个体的发育过程中，干细胞通过自我更新以维持自身数目恒定。是区别于肿瘤细胞的本质特征。（1）对称分裂（symmetry division）：当干细胞分裂时，产生的2个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞．（2）不对称分裂（asymmetry division）：当干细胞分裂时，产生一个子代干细胞和一个子代分化细胞．

（1）在正常生理状态下，干细胞多以不对称分裂方式用于补充组织在自我更新过程中衰老和死亡的细胞。（不对称分裂使机体对干细胞的调控更具有灵活性，可以更灵活地应对机体生理变化的需要。）（1）在正常生理状态下，干细胞多以不对称分裂方式用于补充组织在自我更新过程中衰老和死亡的细胞。（不对称分裂使机体对干细胞的调控更具有灵活性，可以更灵活地应对机体生理变化的需要。）（2）在创伤等应激状态时，由于需要大量的细胞代替和补充坏死的组织细胞，干细胞的分裂方式可能就不再局限于不对称方式，可以以对称分裂的方式快速增殖。 2、自稳性

1、干细胞的分化潜能 干细胞分化具有多潜能性，不同干细胞的分化潜能不同。干细胞可按其分化潜能分为：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。二、干细胞的生物学特性（三）干细胞的分化特征

1、干细胞的分化潜能 2、干细胞的转分化和去分化目前的研究发现，成体干细胞具有一定的可塑性（plasticity），即不同组织来源的成体干细胞之间可相互转化。包括干细胞的转分化和去分化。二、干细胞的生物学特性（三）干细胞的分化特征

一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞，称为干细胞的转分化。一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞，称为干细胞的转分化。 • 1997年，研究首次证明成年动物的造血干细胞可分化成为脑的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。 • 目前，类似的发现还包括成体造血干细胞分化成为肌细胞、肝细胞；神经干细胞转化为造血干细胞等等。

一种干细胞向其前体细胞的逆向转化被称为干细胞的去分化。一种干细胞向其前体细胞的逆向转化被称为干细胞的去分化。 • 实验证明：当把来自成体鼠的造血干细胞注入鼠卵泡的内细胞团后，成体鼠造血干细胞的分化状态发生逆转，开始表达胎鼠的珠蛋白基因，并参与胚胎造血系统的发育。

三、干细胞增殖和分化的调控 内源性调控细胞因子细胞微环境细胞间相互作用细胞外基质

第二节胚胎干细胞 概念： • 胚胎干细胞：是指存在于早期胚胎中，具有多向分化潜能和较长期地进行自我更新的细胞。 • 包括：囊胚内细胞团的胚胎干细胞（ES细胞）早期胎儿（5-9周）原始生殖嵴的生殖干细胞（EG细胞）异常胚胎干细胞——畸胎瘤细胞

一、生物学特性 • 1、形态特征：圆形；细胞体积小；核质比例高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散；核型正常、二倍体；细胞质内散布着大量的核糖体和线粒体。

一、生物学特性 2、生长特征：体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显细胞界限，形似鸟巢。关键:维持干细胞的未分化状态。饲养层细胞（成纤维细胞株）培养体系无饲养层培养体系

一、生物学特性 • 3、生化特征 • （1）表面抗原：胚胎阶段性特异抗原（stage-specific embryonic antigens, SSEA） SSEA是一种糖蛋白，在胚胎发育早期表达，常作为胚胎干细胞的标志之一，具有种属特异性。如：人的ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4，而小鼠的ES细胞表达SSEA-1；

一、生物学特性 • 3、生化特征 • （1）表面抗原：阶段特异性胚胎抗原 • （2）碱性磷酸酶（AKP）碱性磷酸酶（AKP）是鉴定胚胎干细胞分化与否的标志之一。 • （3）端粒酶胚胎性干细胞端粒酶持续高水平表达；使这些细胞在分裂后保持端粒长度，维持细胞的分裂增殖能力。

一、生物学特性 • 4、分化潜能 • 人胚胎干细胞具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。

一、生物学特性 4、分化潜能将胚胎干细胞注射到同源动物或严重免疫缺陷的小鼠的皮下或肾囊中，在注射部位可形成畸胎瘤。（1）体内分化检测畸胎瘤组织可观察到来源于三个胚层的不同的细胞类型，如：平滑肌和横纹肌（中胚层）、神经表皮和神经节（外胚层）。

一、生物学特性 4、分化潜能（1）体内分化（2）嵌合体的形成将供体的胚胎干细胞注入受体胚泡中，然后转移到假孕母体子宫中进一步发育，可得到嵌合体动物，该动物身体中既可观察到供体的组织细胞，又有受体的组织细胞。嵌合体动物的形成是鉴定细胞是否具有多能性的最有说服力的实验证据。

二、胚胎干细胞定向诱导分化 定向分化：在适宜条件下，使胚胎干细胞按照人们的意愿分化为某一特定谱系的细胞，称为胚胎干细胞的定向分化。

二、胚胎干细胞定向诱导分化 意义： ①胚胎干细胞体外诱导分化系统：用于研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变； ②有利于研究胚胎干细胞生长和分化的影响因素； ③研究胚胎发育相关基因的功能；制备转基因动物； ④按照人的意愿来控制人的胚胎干细胞的定向分化，并将这些转化的细胞应用于临床治疗。

二、胚胎干细胞定向诱导分化 • 胚胎干细胞定向分化的常用策略是改变细胞的微环境，目前主要从三方面进行： • 1、在体外培养时改变细胞培养条件，包括： • ①向培养基中加入不同种类的生长因子及化学诱导剂； • 如：表皮生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、维甲酸、二甲基亚砜等等。诱导剂可单独或配伍使用，诱导物不同，干细胞的分化方向亦不同。

二、胚胎干细胞定向诱导分化 • 胚胎干细胞定向分化的常用策略是改变细胞的微环境，目前主要从三方面进行： • 1、在体外培养时改变细胞培养条件，包括： • ①向培养基中加入不同种类的生长因子及化学诱导剂； • ②将胚胎干细胞与其他细胞一起培养，并加入不同类型的细胞来诱导细胞分化； • ③将细胞接种在适当的底物上。这些因素将促使胚胎性干细胞沿着某一特定谱系进行分化。

二、胚胎干细胞定向诱导分化 • 1、在体外培养时改变细胞培养条件 • 2、导入外源性基因来激活细胞的特定分化。 • ①必须明确导入基因定向分化的方向； • ②选择合适的导入时间； • ③选择准确的导入位置。

（四）胚胎干细胞定向诱导分化 • 1、在体外培养时改变细胞培养条件 • 2、导入外源性基因来激活细胞的特定分化。 • 3、体内定向分化即将胚胎性干细胞移植到动物体内的某一部位，在体内的细胞诱导等不同的微环境中，分化为该部位相应的特异细胞。 • 如，将小鼠ES细胞直接移植到帕金森病大鼠模型的心脏和纹状体，成功地分化为相应的心肌细胞和神经元。

三、胚胎干细胞的应用 • 1、基因功能研究 • 2、发育机制研究 • 3、药物监测系统的构建 • 4、细胞替代疗法和组织器官移植

四、诱导性多能干细胞 人胚胎干细胞的主要来源：流产的胎儿和体外受精制造的胚胎

2001年8月，美国时任总统布什宣布对胚胎干细胞研究设限，规定联邦政府对胚胎干细胞研究的资助仅限于研究当时已有的胚胎干细胞，不得资助从新胚胎中提取干细胞进而开展研究。2001年8月，美国时任总统布什宣布对胚胎干细胞研究设限，规定联邦政府对胚胎干细胞研究的资助仅限于研究当时已有的胚胎干细胞，不得资助从新胚胎中提取干细胞进而开展研究。 • 2009年3月，美国总统奥巴马前天签署行政令，推翻2001年禁用政府经费资助人类胚胎干细胞研究的条例，科学家为此鼓掌、支持者高声欢呼。

NIH美国国立卫生研究所关于胚胎干细胞研究的指导原则NIH美国国立卫生研究所关于胚胎干细胞研究的指导原则允许 1.从人胚胎组织中获得新细胞系 2.使用私人资助、已经获得的来自人胚的细胞系进行研究 3.允许新生儿脐带血中提取造血干细胞 4.允许新生儿胎盘组织提取亚全能干细胞禁止 1.使用来自胎儿组织的细胞系进行研究 2.用干细胞创建人胚胎的研究 3.将人胚胎干细胞与动物胚胎结合的研究 4.使用干细胞进行生殖克隆 5.来自为研究目的而专门创建的胚胎的干细胞有关研究

四、诱导性多能干细胞 人胚胎干细胞的主要来源：流产的胎儿和体外受精制造的胚胎诱导产生的多功能干细胞（ｉＰＳ细胞）

for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent

诱导产生的多功能干细胞（ｉＰＳ细胞） • 2006 年, Takahashi 和Yamanaka将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞, 进而获得了类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES 细胞)多能性干细胞, 称之为“诱导产生的多能性干细胞”(induced pluripotent stem cells, iPS 细胞). 这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态, 因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。 • ２００７年１１月，美国和日本科学家分别宣布独立发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，得到的干细胞称为诱导多功能干细胞，这一发现分别被《自然》和《科学》杂志评为２００７年第一和第二大科学进展。

诱导产生的多功能干细胞（ｉＰＳ细胞） • ２００８年４月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成ｉＰＳ细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 • ２００９年２月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的ｉＰＳ细胞培育出血小板，而且从技术上说用ｉＰＳ细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的ｉＰＳ细胞培育出鼠角膜上皮细胞。 • ２００９年３月伊始，ｉＰＳ细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为ｉＰＳ细胞的方法；美国科学家则在《细胞》杂志上宣布，他们可以将ｉＰＳ细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证由此获得的神经元细胞的基本功能不受影响。

诱导产生的多功能干细胞（ｉＰＳ细胞） • ２００９年７月，ｉＰＳ细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据英国《自然》杂志网站２３日报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用ｉＰＳ细胞克隆出活体实验鼠，首次证明ｉＰＳ细胞具有全能性。该成果让人们看到了ｉＰＳ细胞具有实用性。 • 继前不久在世界上首次得到完全由诱导多能干细胞（即iPS细胞）发育的小鼠之后，中国科学家在iPS细胞研究领域又取得重大进展：首次从孕妇产前的羊水细胞中高效快速建立iPS细胞，所需时间只有6天，为目前人类iPS细胞相关报道中最短。 • 美国《时代》周刊在其网站上公布了2010年十大医学突破名单，其中“可降低HIV感染风险的抗艾滋病药”、“人工合成细胞”、“老年性痴呆症的血液检测”及“更快更安全培育iPS细胞”等成果入选。

第二十五章 干细胞及其利用