第二章 基因工程及其在食品科学中的应用

1. 第二章 基因工程及其在食品科学中的应用 第一节 基因工程基础 三、基因工程的载体 基因工程的载体(vector)概念 基因工程载体的分类：按照介导的作用目的；按照导入的受体 （一）大肠杆菌载体 分为：① 质粒载体；② 噬菌体载体；③ 柯斯质粒(黏粒)载体

2. 1、质粒载体 (1) 质粒的生物学特性 质粒 (plasmid)：是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质 ，一般为双链(double strand，ds)的共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA). ① 质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质进行复制和转录，是宿主的共生物

3. ② 质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)，也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象 ③ 彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(incompatibility group)，而彼此能够共存的亲和质粒则属于不同的不亲和群

4. (2) 质粒的分类 有三种分类方法： 根据赋予宿主的遗传性状分类、根据转移能力分类和根据复制控制类型分类。 ① 根据赋予宿主的遗传性状，一般大肠杆菌质粒可分为F因子(性因子)、R质粒(抗药性因子)、Col质粒(产生大肠杆菌素因子)等 ② 根据转移能力，一般可将大肠杆菌质粒分为接合型质粒和非接合型质粒 ③ 根据复制控制类型，一般可将大肠杆菌质粒分为严紧型复制控制质粒（stringent plamid ）和松弛型复制控制质粒（relaxed plasmid ）

5. （3）质粒载体的条件及选择 质粒克隆载体是指能将外源基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的质粒DNA 理想的质粒克隆载体一般具备以下条件： ① 分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上；② 能插入、运载一定大小的外源基因；③ 在宿主细胞内能自主复制；④ 在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能；⑤ 分子量小，易于操作，一般为松弛型复制控制；⑥ 容易控制，安全可靠。

6. （4）质粒载体例解 ① pBR322：它曾是一种应用最为广泛的克隆载体，现许多应用广泛的质粒载体都由其衍生而来。其带有氨苄青霉素抗性基因ampr，四环素抗性基因tetr两个选择标记基因，属于松弛型复制控制质粒载体 pBR322的结构

9. 为了方便起见，统一规定该环状质粒载体DNA分子中核苷酸的计数从EcoR I的识别序列开始。在该识别序列GAATTC中，以第一个T为核苷酸1，然后沿着从tetr基因到ampr基因的方向顺序计数，如此画出该质粒的碱基序列结构图

10. ② Bluescript Ml3+、Bluescript Ml3-：是一对带有M13噬菌体DNA复制起点ori的质粒载体。这对载体可在体内或在体外产生互补于插入到其多克隆位点的外源双链DNA中任一条链的单链DNA或RNA。 2、噬菌体载体 （1）噬菌体的生物学特性 噬菌体(bacteriophage)是一类细菌病毒的总称 ① 噬菌体颗粒的外壳是蛋白质，内部是核酸 ② 噬菌体的感染效率极高。

11. ③ 噬菌体的生命周期可分为溶菌周期和溶原周期 溶菌周期是指噬菌体吸附到宿主细胞表面后注入DNA，经过DNA复制及蛋白质合成，组装成子代噬菌体颗粒，最后使宿主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒的生长周期 溶原周期是指噬菌体在感染过程中不产生子代噬菌体颗粒，而将噬菌体DNA整合到宿主细胞染色体DNA中；成为其组成部分的生长周期 只具有溶菌周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。 具有溶原周期的噬菌体被称为温和噬菌体。

12. 烈性噬菌体的生活周期

13. 温和噬菌体的生活周期 裂解循环 溶源态

14. 具有一套噬菌体完整基因组的细菌被称为溶原性细菌(1ysogen)。以温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶原性细菌的过程被称为溶原化(1ysogenization)。整合的噬菌体DNA是指插入宿主细胞染色体DNA中的噬菌体DNA；而以质粒DNA分子形式存在的噬菌体DNA被称为非整合的噬菌体DNA。具有一套噬菌体完整基因组的细菌被称为溶原性细菌(1ysogen)。以温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶原性细菌的过程被称为溶原化(1ysogenization)。整合的噬菌体DNA是指插入宿主细胞染色体DNA中的噬菌体DNA；而以质粒DNA分子形式存在的噬菌体DNA被称为非整合的噬菌体DNA。

15. 噬菌体的侵染循环

16. λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λDNA组成，λ噬菌体颗粒由头与尾两部分组成。头部装载了其整个基因组λDNA。λDNA为一长度约48.5kb的线状双链DNA分子，可以分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的5’处各有一12个碱基长的互补单链(从而构成黏性末端)。λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λDNA组成，λ噬菌体颗粒由头与尾两部分组成。头部装载了其整个基因组λDNA。λDNA为一长度约48.5kb的线状双链DNA分子，可以分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的5’处各有一12个碱基长的互补单链(从而构成黏性末端)。 （2）λ噬菌体载体

17. λ－DNA的结构

18. λDNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，当入噬菌体感染宿主细胞时，λDNA被注入宿主细胞后会迅速通过黏性末端的互补作用形成环状双链DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称作cos位点(cohesive-end site)。

19. λ噬菌体在宿主细胞中繁殖时，复制的DNA必须被包装到已组装好的头部，并再接上尾巴后才能成为成熟的噬菌体颗粒，才具备感染大肠杆菌细胞的能力。噬菌体要具有感染性，被包装的DNA必须具有一定的长度。野生型λ噬菌体DNA(48.kb)被包装的效率最高，并且所形成的噬菌体颗粒具有最强的感染性。如果被包装的DNA与入噬菌体载体的总长度短于野生型λDNA长度的78％或者长于野生型λDNA长度的105％，那么就不能形成具有感染性的噬菌体颗λ噬菌体载体中取代了非必要基因的外源基因可随宿主细胞一起复制和增殖。λ噬菌体在宿主细胞中繁殖时，复制的DNA必须被包装到已组装好的头部，并再接上尾巴后才能成为成熟的噬菌体颗粒，才具备感染大肠杆菌细胞的能力。噬菌体要具有感染性，被包装的DNA必须具有一定的长度。野生型λ噬菌体DNA(48.kb)被包装的效率最高，并且所形成的噬菌体颗粒具有最强的感染性。如果被包装的DNA与入噬菌体载体的总长度短于野生型λDNA长度的78％或者长于野生型λDNA长度的105％，那么就不能形成具有感染性的噬菌体颗λ噬菌体载体中取代了非必要基因的外源基因可随宿主细胞一起复制和增殖。

20. λDNA噬菌体载体的优点: ①可携带较长的外源DNA片段。 ②重组后的DNA分子可在体外被包装成噬菌体颗粒。与用DNA直接转染细菌相比，包装成的噬菌体颗粒具有更强的感染宿主细胞的能力。 ③重组的噬菌体容易筛选和贮存。 λ噬菌体载体的分类: 一般可将入噬菌体载体分为插入型载体和置换型载体 。

21. 插入型载体(insertion vector)，是指在基因组的非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位点可供外源DNA插入，而不缺失其本身任何片段的λ噬菌体载体 置换型(取代型)载体(replacement vector)，是指在基因组的非必要基因区内两个或两个以上的限制酶切位点间的DNA区段可被插人的外源DNA片段所置换的λ噬菌体载体

22. λ噬菌体载体的选择: 并没有一种可以适于克隆所有DNA片段的入噬菌体载体。具体选择时，应该考虑以下几点： ① 如果要从染色体DNA来构建基因组文库，那么可以选择置换型的λ噬菌体载体，因其可容纳DNA较大片段。 ② 如果要从染色体DNA中分离某一基因，而又不需构建完整基因组文库，那么选择的自由度就较大。 ③ 如果需要构建cDNA文库，那么常选λgt10或λgt11插入型载体；如果考虑选用抗体探针，那么常选λgt11这一有效表达载体。

23. （3）M13噬菌体载体家族 M13噬菌体的侵染循环 M13噬菌体的侵染循环

24. ① M13噬菌体的特性 M13是丝状噬菌体，含有长度为6407个核苷酸的闭合环状单链DNA基因组。当M13感染宿主大肠杆菌细胞时，侵入的单链噬菌体DNA转变为双链复制型(RF)。 双链复制型在复制时产生大量的单链DNA。单链DNA再被外壳蛋白包装为成熟的噬菌体颗粒。 在宿主大肠杆菌细胞生长过程中，子代噬菌体颗粒被释放出来。

25. ②M13噬菌体载体的优点 A 由于M13单链DNA的复制型呈双链环形，因此，此时的DNA可同质粒DNA一样进行提取和体外操作； B 不论是双链的还是单链的M13DNA均能感染宿主细胞，产生噬菌斑或形成侵染菌落； C 由于M13是丝状噬菌体，其长度不受外壳蛋白包装的限制，因此根据重组DNA的长度，被包装成的噬菌体颗粒可大可小。

26. 3、柯斯质粒载体 柯斯质粒载体(Cosmid vector)，也称黏粒载体。 是指一类由人工构建的含有λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。其最初是为克隆和增殖基因组的大片段DNA而设计的。

27. (1) 柯斯质粒载体的组成 柯斯质粒本身的分子量较小，一般为4～6kb。其基因组由以下部分组成： ① 1个质粒复制起始区域复制子； ② 至少1个抗药性选择标记基因； ③ 至少1个限制酶的单一识别切割位点； ④ 1个λ噬菌体黏性末端片段cos位点。 Cos质粒pJB8

28. (2) 柯斯质粒载体的特点 ① 具有质粒载体的特性：它带有质粒的复制子，因此能像质粒DNA一样在寄主细胞内复制，也能在氯霉素的作用下进行扩增，也带有抗菌素抗性基因 ② 具有λ噬菌体载体的特性：它在与适宜长度的外源DNA片段重组后，可在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效地转入对λ噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞 ③ 具有高容量的克隆能力：质粒载体的克隆容量一般为10kb，λ噬菌体载体的克隆容量理论极限值是23kb，一般为15kb左右，而柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右

29. (二) 酵母载体 酵母是单细胞低等真核生物，其基因组大小仅为大肠杆菌基因组的4倍。酵母可人工培养，且繁殖迅速，并可像细菌一样进行实验操作。酵母的生命周期包括单倍体和二倍体两种形式，它对基因表达产物有完善的后加工系统。 1、酵母载体的特点 ① 能在大肠杆菌中克隆，且具较高的拷贝数。 ② 含有在酵母中便于选择的遗传标记 ③ 含有合适的限制酶切割位点，以便外源基因的插人。

30. 2、酵母载体的分类 根据复制方式，一般可将酵母载体分为整合型载体、复制型载体和附加体型载体 (1) 整合型载体(YIP) 该类载体由大肠杆菌质粒和酵母DNA片段构成。由于其酵母DNA片段提供的亮氨酸基因(leuZ+)部分不含有自主复制起始区，而只作为选择标记，因此该类载体在酵母细胞中不能自主复制。 (2) 复制型载体(YRP) 该类载体是将酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。其中酵母DNA片段不仅提供了选择标记，还携带来自酵母染色体DNA的自主复制顺序(ARS)。因为同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以该类载体能在这两种细胞中存在和复制。因此，该类载体属于穿梭载体。

31. 所谓穿梭载体(shuttle vector)，是指可在两种截然不同的生物细胞中复制的载体 (3) 附加体型载体(YEP) 该类载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒及酵母染色体的选择标记组成。 YEP的结构

32. (三) 植物载体 植物载体具体包括农杆菌质粒载体、病毒载体等，农杆菌质粒载体又可分为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，At)诱导肿瘤质粒(tumor-inducing plasmid，Ti plasmid)载体和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)诱导发根质粒(root-inducingplasmid，Riplasmid)载体。 在所有这些植物载体中，根癌农杆菌诱导肿瘤质粒载体是最主要的 根癌农杆菌主要感染被子植物中的双子叶植物。 根癌农杆菌感染植物会致其形成冠瘿瘤，而这种肿瘤的形成是由根癌农杆菌中的质粒引起的。因此，该质粒被称为诱导肿瘤质粒，简称Ti质粒。

33. 1、Ti质粒的基本性质 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的双链NA分子。其分子量为1.2X108，长约185kb，相当于细菌染色体的3％一5％。 根据植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱的种类，一般可以将Ti质粒分为以下类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)等。

34. 2、Ti质粒的基本结构 一般可将Ti质粒分为四个结构区域：T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区。 (1) T-DNA区(transferred-DNA region)。T-DNA是在根癌农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞内的一段DNA，因此，被称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 (2) Vir区(virulence region)。该区段上的基因能够激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性，因此，被称为毒性区。 (3) Con区(region encoding conjugation)。该区段上存在着与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒的转移。因此，该区被称为接合转移编码区。 (4) Ori区(origin of replication)。该区段上的基因调控了质粒的自我复制，因此，被称为复制起始区。

35. 3、植物基因工程中几种载体的定义 (1) 中间克隆载体(intermediate cloning vector)。这是指插入了根癌农杆菌Ti质粒T-DNA片段、目的基因、标记基因等的大肠杆菌质粒载体。它是构建中间表达载体的基础质粒。 (2) 中间表达载体(intermediate expression vector)。这是指含有可使外源基因在植物细胞中表达的特异启动子的中间克隆载体。它是构建植物表达载体的基础质粒。 (3) 卸甲载体(disarmed vector)。卸甲载体多指去除了编码致瘤作用基因、经改造的根癌农杆菌Ti质粒载体。其是构建植物表达载体的受体质粒。 (4) 植物表达载体(plant expression vector)。这是指最后将目的基因导人植物细胞表达的载体。它由中间表达载体和卸甲载体构建而成。

36. 4、植物表达载体 (1) 植物表达载体(中间表达载体)中常用的启动子。 (2) 一元载体系统 ① 共整合载体(co-integrated vector) ② 拼接末端载体(split-end vector，SEV) (3) 双元载体系统 ① 双元载体系统的构建原理 ② 双元载体的构建

37. (四) 动物载体 DNA病毒是外源DNA导入哺乳动物细胞的理想载体。其中，常用的载体由野生型猿猴空泡病毒40(SV40)基因组DNA等改建而成。 SV40病毒 ： 猿猴空泡病毒40(simian vacuolating virus 40)，即SV40病毒，是一种小型20面体的颗粒，外壳由VPl、VP2和VP3三种病毒蛋白构成，中间包装着长5.2kb的环状基因组DNA。 SV40基因组DNA分为早期和晚期两大区域。早期区在溶原生长中一直表达，而晚期区仅在DNA复制后的一段时间中表达，产生病毒外壳结构蛋白。早期区与晚期区之间则为复制起点。

38. 四、基因工程中的一些主要分子生物学方法 (一) 核酸分子探针的标记 探针(probe)是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。 核酸分子探针是指能与互补核酸序列复性杂交的特定已知核酸片段。 ． 根据来源性质，一般可将核酸分子探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、化学合成的寡核苷酸探针等。 根据标记的方式，可将核酸分子探针的标记法分为体内标记法和体外标记法。 ，

39. 第二章 基因工程及其在食品科学中的应用 第一节 基因工程基础 (三) 植物载体 1、Ti质粒的基本性质 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的双链DNA分子。其分子量为1.2X108，长约185kb，相当于细菌染色体的3％一5％。 根据植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱的种类，一般可以将Ti质粒分为以下类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)等。

40. 2、Ti质粒的基本结构 一般可将Ti质粒分为四个结构区域：T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区。 (1) T-DNA区(transferred-DNA region)。T-DNA是从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞内的一段DNA，因此，被称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 (2) Vir区(virulence region)。该区段上的基因能够激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性，因此，被称为毒性区。 (3) Con区(region encoding conjugation)。该区段上存在着与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒的转移。因此，该区被称为接合转移编码区。 (4) Ori区(origin of replication)。该区段上的基因调控了质粒的自我复制，因此，被称为复制起始区。

41. 3、植物基因工程中几种载体的定义 (1) 中间克隆载体(intermediate cloning vector)。这是指插入了根癌农杆菌Ti质粒T-DNA片段、目的基因、标记基因等的大肠杆菌质粒载体。它是构建中间表达载体的基础质粒。 (2) 中间表达载体(intermediate expression vector)。这是指含有可使外源基因在植物细胞中表达的特异启动子的中间克隆载体。它是构建植物表达载体的基础质粒。 (3) 卸甲载体(disarmed vector)。卸甲载体多指去除了编码致瘤作用基因、经改造的根癌农杆菌Ti质粒载体。其是构建植物表达载体的受体质粒。 (4) 植物表达载体(plant expression vector)。这是指最后将目的基因导人植物细胞表达的载体。它由中间表达载体和卸甲载体构建而成。

42. 4、植物表达载体 (1) 植物表达载体(中间表达载体)中常用的启动子。 (2) 一元载体系统 ① 共整合载体(co-integrated vector) ② 拼接末端载体(split-end vector，SEV) (3) 双元载体系统 ① 双元载体系统的构建原理 ② 双元载体的构建

43. (四) 动物载体 DNA病毒是外源DNA导入哺乳动物细胞的理想载体。其中，常用的载体由野生型猿猴空泡病毒40(SV40)基因组DNA等改建而成。 SV40病毒 ： 猿猴空泡病毒40(simian vacuolating virus 40)，即SV40病毒，是一种小型20面体的颗粒，外壳由VPl、VP2和VP3三种病毒蛋白构成，中间包装着长5.2kb的环状基因组DNA。 SV40基因组DNA分为早期和晚期两大区域。早期区在溶原生长中一直表达，而晚期区仅在DNA复制后的一段时间中表达，产生病毒外壳结构蛋白。早期区与晚期区之间则为复制起点。

44. 四、基因工程中的一些主要分子生物学方法 (一) 核酸分子探针的标记 • 探针(probe): 是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。 • 核酸分子探针:是指带有标记的某一特定DNA或RNA片段，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。

45. 核酸探针的类型和称谓常有以下几种： 基因组DNA探针 核酸探针 cDNA探针 (来源) RNA探针 化学合成的寡核苷酸探针 放射性标记探针 32P、35S、3H、125I等标记探针 探针标记 (标记物种类)非放射性标记探针 生物素、地高辛配体、荧光素

46. 体内标记法 • 探针标记法 化学标记法 • (方式)体外标记法 • 酶促标记法 • 体内标记法：将经放射性同位素标记的化合物作为底物引入活细胞，经细胞代谢处理而将生物大分子等加以标记的方法 • 化学标记法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生化学反应而将标记物接到探针分子上的方法 • 酶促标记法：是指将标记物预先标记在核苷酸上，然后利用酶促方法将核苷酸掺入到探针分子中，或将核苷酸上的标记基团交换到探针分子上的方法

47. 根据酶促反应的条件，又可将酶促标记法分为：根据酶促反应的条件，又可将酶促标记法分为： 切刻平移法 酶促标记法 随机引物法 末端标记法 1、切刻平移法（nick translation） （1）原理 利用DNaseI内切酶活性、DNA聚合酶I的5 ’ →3’聚合酶活性和5 ’→3’外切酶活性。产生均匀标记的探针。

48. （2）流程 在Mg2+的存在下，利用DNaseI的内切核酸酶活性在待标记的DNA双链上随机形成单链切刻→利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’ →3’核酸外切酶活性在切刻处将旧链从5’逐步切除→以互补的DNA单链为模板，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5 →3’聚合酶活性将dNTP(其中一种或几种经过标记)顺序连接到切刻3’端的一OH上，延伸合成新的DNA单链，从而形成标记的DNA探针。 （3）特点 适用于各种双链DNA的标记，不适用于单链DNA和RNA的标记

49. DNaseI 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 大肠杆菌DNA聚合酶I 5’ →3’核酸外切酶活性 单链探针 逐步切除 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 大肠杆菌DNA聚合酶I 5 →3’聚合酶活性 标记物来自DNTP 切刻平移法制备探针的示意图

50. 5‘ 3’ 5‘ 3’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ 3‘ 5’ 3‘ 5’ 切刻平移法制备探针原理 (a)双链的DNA分子 (a) (b)带有3’-OH末端的单链缺口 (b) 5‘ 3’ 3‘ 5’ (c) polⅠ从5‘-P移去一个核苷酸 (c) * 5‘ 3’ 3‘ 5’ (d) polⅠ将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸 (d) (e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5’-3‘方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链 * * * * * * * (e)