Reparaţiile ADN

1. Reparaţiile ADN Corectarea unei împerecheri greşite, sau a lipsei de complementaritate între nucleotidele a două catene, ale unui fragment de ADN, sunt denumite reparaţii ADN. Dacă ADN este lezat, sau replicat incorect rezultă că nuclotidele situate pe cele 2 catene nu mai sunt complementare (AT sau CG). Se spune că are loc o împerechere greşită între nucleotide. Repararea vizează înlocuirea unei baze azotate, sau a unei nucleotide, sau a unui fragment de acid nucleic, de către nucleotide complementare secvenţei celeilalte catene.

2. Bazele greşite, lezate • Natura chimică a bazelor azotate este esenţială pentru mesajul genetic. Numeroase modificări ale acestor baze pot antrena mutaţii. • Modificările chimice sunt reprezentate de: • dezaminarea adeninei şi formarea hipoxantinei, în care hipoxantina este preferenţial complementară cu C mai mult decât cu timina; • metilarea citozinei în 5 metil citozină, o face mai complementară cu A decât G.

3. Mutaţia, rezultă din legături anormale între baze nucleotidice vecine precum dimerii timinei. • Căldura degajată în reacţia de hidroliză a bazelor adesea a purinelor, conduce la situsuri apurinice (fără purine). • Agenţii chimici din mediu pot fi mutageni. • Astfel, există analogi ai structurii bazelor, care dau nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se hibridează preferenţial cu guanina, sau două aminopurine care se leagă de citozină.

4. Unii agenţi mutageni ca 2 metilnitrosamină reacţionează între baze, sau în interiorul dublului helix ca bromura de etidiu. • Excizia bazelor lezate • Înaintea unei baze deteriorate reparaţia se poate face prin simpla excizie a bazei urmată de înlocuirea cu o bază a nucleotidei normale. • Excizia se face printr-o ADN glicozilaza care deschide dublul helix, apoi hidrolizează legătura N glicozidică a bazei lezate şi lasă o nucleotidă apurinică.

6. Repararea, corectarea împerecherilor greşite – • Unele baze azotate din ADN existent, sub mai multe forme tautomere, rezultă prin deplasarea inconstantă a hidrolizei şi trecerea fracţiunii amino în enol. • Aceste forme sunt mai rare într-un ADN matriţă în curs de replicare; unele baze pot fi momentan sub formă tautomeră. • Forma tautomeră a adeninei este imino-adenina, care nu se hibridează cu timina ci cu citozina.

7. La fel enol timina se hibrideaza mai bine cu guanina, decât cu adenina şi enol guanina se leagă cu timina mai bine decât cu citozina. • Astfel ADN polimeraza, va condensa pe ADN-ul pe care-l construieşte, baze azotate diferite faţă de cele normale (aşteptate). • Dacă bazele azotate ale catenei model vor lua forma obişnuită, ele nu se vor putea hibrida cu bazele catenei noi şi vor rezulta împerecheri greşite.

9. Transmiterea împerecherilor greşite • O împerechere greşită face să apară 2 nucleotide necomplementare în aceeaşi poziţie a catenelor de ADN. • Fiecare din cele 2 catene în cursul mitozei următoare se vor replica producând o nucleotidă complementară. • Nucleotida anormală, va angaja o tranziţie permanentă într-una din cele 2 celule fiice. • În cazul, situării pe lanţurile parentale a unei perechi de nucleotide A=T.

10. La generaţia următoare, lanţul care posedă A, în urma unei iminizări, produce o catenă complementară cu citozina, în loc de timina aşteptată (C=A). • În altă celulă secvenţa este normală T=A. • Începând de aici toate celulele în care ADN a fost replicat de la catena purtătoare de substituţie, vor avea la acest nivel o pereche G=C. • Substituţia a devenit permanentă. • Dacă ea este situată într-o genă poate determina o mutaţie.

12. Excizia unui fragment lung de ADN • Dacă un fragment de ADN este lezat, simpla excizie a unei baze nu este suficientă pentru reparaţie şi în cursul replicării sunt imediat repetate, deoarece dublul helix nu se formează normal. • O endonuclează secţionează catena purtătoare a leziunii, la o distanţă de 5 nucleotide. • Apoi sub efectul unei topoizomeraze şi a helicazei (sau factorul TFIIH), catena lezată este separată de catenele normale. • Începând de la extremitatea 3OH a breşei astfel creată, o ADN polimeraza  reconstituie fragmentul complementar şi ultima legătură va fi inchisă prin ADN ligaza.

13. Modelul Holliday • Deschiderea unei breşe într-o catenă ADN şi derularea dublului helix, permit unor fragmente de ADN monocatenar să se hibrideze cu secvenţele complementare ale cromozomului omolog. • În cazul unor greşeli capetele celor 2 catene schimbate, vor putea fi reânchise prin ADN ligaza. • O asemenea structură rezultată prin intercreşterea celor două catene ADN omoloage se numeşte structură Holliday de la numele cercetătorului (1964).

14. Această structură este mobilă şi schimbul se poate propaga prin glisarea structurii de-a lungul celor două helixuri mergând în acelaşi sens. • Se poate reprezenta structura Holliday separând helixurile în formă de cruce. • Aceasta permite să se observe că există două moduri de separare a celor două helixuri, fie secţionând orizontal şi obţinând o schimbare a fragmentelor de ADN între 2 cromozomi, fie secţionând vertical şi ajungând la un schimb complet de ADN între cei doi cromozomi, deasupra punctului de încrucişare.

16. Crossing-over • Schimburile între cromozomii omologi pot duce la schimbul de fragmente, sau de catene întregi de ADN. • În meioză, în special, aceste schimburi se produc frecvent între cromozomul de origine maternă şi paternă, astfel încât genele cromozomilor din celulele fiice (gameţi), sunt recombinări heterogene ale fragmentelor. • Rezultatul implică un amestec de caractere ereditare ale celor doi părinţi şi constituie patrimoniul noului individ.

20. Mutaţii cromozomiale –macroleziuni • Căile de producere cunoscute sunt prin: mutaţie, inversie, translocaţie în interiorul cromozomului. • Mutaţia, rezultă din legături anormale între baze nucleotidice vecine precum dimerii timinei. Prin mutaţii cromozomiale se produc modificări substanţiale în structura acestora. • Dacă o regiune a cromozomului suferă deleţie, aceasta determină scăderea materialului genetic în cromozomul mutant. • În duplicaţie are loc copierea unei regiuni existentă a cromozomului. • Ambele, duplicaţiile şi deleţiile pot fi create printr-un crossing-over anormal în timpul meiozei.

21. Căldură degajată în reacţia de hidroliză a bazelor adesea a purinelor, conduce la situsuri apurinice (fără purine). • Agenţii chimici din mediu pot fi mutageni. Astfel, există analogi ai bazelor, care dau nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se hibridează preferenţial cu guanina. • Unii agenţi mutageni ca 2 metilnitrosamina reacţionează între baze, sau în interiorul dublului helix similar bromurii de etidiu. • Inversia • Inversia reprezintă schimbarea orientării unei secvenţe ADN. • Se desfăşoară când cromozomul este fragmentat şi reconectat în două regiuni. Regiunea desprinsă suferă o buclă internă, o întoarcere inversă, pierde succesiunea normală, apoi este reconectată.

22. In inversie nu se schimbă cantitatea de material genetic din cromozom. • Translocaţia implică 2 cromozomi. Într-o translocaţie simplă o singură regiune a unui cromozom se desprinde şi se ataşează la alt cromozom. • Translocaţia poate fi şi reciprocă. • Inversia şi translocaţia pot conduce la deficienţe totale şi la duplicrea materialului genetic după meioză.

25. Modificări structurale ale genelor sau microleziuni • Căile de producere cunoscute sunt prin: duplicaţie, amplificarea, fuziunea genelor deleţie, inserţia, substituţia, mutaţii punctuale în interiorul cromozomului. • Duplicaţia, multiplicarea, repetiţia unui fragment de ADN poate cuprinde o genă în întregime sau un fragment, se poate realiza în acelaşi sens sau în sens invers faţă de gena duplicată. • Amplificarea este multiplicarea în tandem a secvenţelor obişnuit unice (mărimea tandemului fiind considerabilă). • Fuziunea genelor este rezultatul unui rearanjament cu dublă rupere a două gene diferite şi transpoziţia de la una la alta. • Inserţia reprezintă introducerea unei secvenţe de transpozoni sau secvenţe virale într-o genă. Se face prin mecanisme complexe: recombinare inegală, translocaţie, conversie genică, bucle cromatidice.

26. Substituţia • Reamplasarea, sau înlocuirea unei nucleotide prin alta, în structura primară a unui acid nucleic poartă denumirea de substituţie.

27. Substituţia • O substituţie poate conduce la rezultate foarte diferite după transducţie. Aceasta depinde de poziţie în raport cu cadrul lecturii. • O substituţie într-un codon, se poate traduce prin acelaşi aminoacid se spune că substituţia este sinonimă sau silenţioasă. Nu va avea loc modificarea aminoacidului tradus, deci nici a proteinei rezultate prin transducţie. • Substituţie missens-tip de mutaţie prin substituţia nucleotidelor care determină modificarea unui anumit codon astfel încât el codifică alt aminoacid decât acela pe care îl codifică în mod normal. • Tranziţia sau mutaţia punctuală în care o bază purinică este transformată în alta purinică G-A sau pirimidinică în alta pirimidinică C-T. • Transversia este mutaţia punctuală în care o bază purinică este transformată în pirimidinică G-T sau pirimidinică în purinică C-A.

28. Substituţia non sens se produce în molecula de ADN, care determină înlocuirea într-un ARNm transcript al unui codon sens cu unul non-sens, un aminoacid diferit. • Prin traducerea acestui ARNm rezultă un polipeptid trunchiat. • O substituţie într-un codon poate fi tradusă printr-un codon de terminare: se spune că este non-sens. Proteina tradusă va fi întreruptă în acest loc.

31. Mutaţia • Mutaţii punctuale constau în substituţie, supresie (lipsă) sau adiţia de baze. • Mutaţii în regiunile codante determină schimbarea unui aminoacid din proteină şi a funcţiei proteinei. • Mutaţiile silenţioase liniştite modifică codonul dar nu şi aminoacidul. Foarte rar determină eliminarea exonului (episajul). • Mutaţiile non-sens duc la formarea unui codon STOP, UAA, UAG, UGA şi proteina este astfel întreruptă adesea nefuncţională sau cu activitate reziduală, redusă. Uneori determină şi episajul exonilor.

33. Atunci când o substituţie nesinonimă se produce în ADN -ul unui subiect (genotip) şi conduce la încorporarea unui aminoacid diferit în structura primară a unei proteine are ca rezultat apariţia unor caractere diferite (mutaţie), în fenotipul individului. • Orice altă modificare antrenând o proteină tradusă mai lungă, sau foarte scurtă, sau un decalaj în citirea codonilor se traduce printr-o secvenţă primară diferită şi deci în majoritatea cazurilor o mutaţie în fenotipul individului.

34. Mutaţia Arg 3500 Gln apoB • Mutaţia 3500 a apolipoproteinei B-100 rezultă dintr-o substituţie nesinonimă G-A. Astfel prin transducţie se înlocuieşte în poziţia 3500 aminoacidul; arginina va fi înlocuită cu glutamina din proteina apoB-100.. • Prezenţa acestei mutaţii nu antrenează modificări ale situsului de restricţie şi ele nu pot fi detectate direct printr-un polimorfism a lungimii fragmentelor de restricţie. • Prezenţa acestei mutaţii regăsită în Franţa la o persoană din 500, este un factor de risc vis-a-vis de ateroame şi boli cardiovasculare, deoarece ea perturbă legătura apolipoproteinei B-100 cu receptori celulari ai lipoproteinelor cu densitate mică (LDL).

36. Mutaţii prin adiţie şi deleţie • Segmente mari sunt inserate sau pierdute de către genom. Cauzează achiziţionarea sau pierderea uneea sau mai multor gene. • Probabilitatea este de 1 până la 5 mutaţii per replicare • Mutagenii • Agenţi care induc mutaţii. Multe survin natural • Pot fi utilizate în laborator pentru a creşte rata mutaţiilor şi cresc şansele izolării mutantelor de interes

37. Mutaţiile care perturbă citirea • Inserţia sau deleţia unei baze în regiunea codantă decalează cadrul de citire şi determină apariţia unui codon stop • după mai multe baze (10-100 de la mutaţie). • Mutaţii care controlează expresia unei gene • Sunt situate în zona reglatoare a genei de exemplu: • - în promotor la nivelul codonului de iniţiere a transcripţiei sau la nivelul situsului de poliadenilare. Pot fi situate pe gene codante pentru proteine care intervin în reglarea expresiei , exemplu gene codante pentru factori de transcripţie.

38. Mutaţii de replicare sau dinamice • Sunt erori ale replicării mitotice sau premeiotice care determină o alunecare a unor zone presupuse instabile ale genomului. • Ele determină o amplificare (mutaţie dinamică) sau o reducere a zonelor repetate. Persistă mai multe generaţii şi cresc în cursul generaţiilor. Se regăsesc în anumite maladii genetice pentru care s-au observat fenomenul de anticipare şi rezultatul instabilităţii repetiţiei di sau trinucleotidice. • Exemplu, numărul de repetiţii de trinucleotide este foarte variabil în genom de la un subiect la altul (polimorfism multialelic). • Aceste repetiţii de trinucleotide sunt utilizate ca markeri genetici. Totuşi când se depăşeşte un anumit număr de repetiţii pe locus au efect patologic.

39. Mutaţiile genetice sunt responsabile de expansiunea secvenţelor scurte (CGG) în boala X fragil (cu număr de repetiţii peste 50). • Într-o primă generaţie se observă o premutaţie care conţine un număr de repetiţii peste normal. • În generaţia următoare creşte numărul premutaţiei devine mutaţie şi apare boala la vârsta precoce. Aceste expansiuni îşi schimbă talia mărimea în timpul transmiterii bolii de la părinţi la copii (cromozomul X). • Aceste mutaţii sunt dinamice şi explică variabilitatea fenotipului, penetranţa şi variabilitatea bolilor genetice în care apar. • Mutaţiile prin inserţia de elemente mobile • Inserţia de transpozoni secvenţe LINE sau Alu se poate produce într-o genă prin retrotranspoziţie.

40. Amprenta parentală • Se poate determina originea maternă sau paternă a unei gene prin markeri polimorfi. Expresia fenotipică a unor mutaţii diferă dacă afectează un cromozom de origine maternă sau paternă fenomen numit amprentă parentală. S-a studiat unul dintre mecanisme, metilarea unor gene care se face diferit pe cromozomii materni şi paterni în timpul gametogenezei. • Mutaţii în mitocondrie • Sunt transmise de mamă şi se pot observa toate tipurile întâlnite şi la ADN nuclear.

41. Mutagenii chimici • Ei determină citirea greşită a ADN în timpul replicării determinând mutaţie- principiul care stă la baza acţiunii unor citostatice • Baze Analoage • Radiaţiile ca factori mutageni • Razele UV (260 nm) şi radiaţiile solare cu lungime de undă mică determină formarea de dimeri de pirimidine prin legături • C=C; T=T • ADN pol citeşte greşit rezultând mutaţii • Radiaţii ionizante • Se caracterizează prin: • -Energie mare • -Fragmentează ADN • -Efect letal • 5-Bromouracil seamănă cu T din ADN şi se împerechează cu G-Intercalată • Bromura deEthidium- distorsionează topografia DNA. Agenţi Alkilanţi- introduc grupări alkil (metil, etil) în bazele componente ale ADN şi perturbă citirea.

42. Testul Ames pentru Carcinogeneză • Foloseşte Salmonella enterica: o tulpină care nu sintetizează histidina. Se cultivă pe mediu fără histidină. Substanţa chimică de testat (medicament) se introduce în mediu în microcomprimat (ca pt antibiogramă). • Dacă substanţa este mutagenă în jurul microcomprimatului se dezvoltă un nr. mare de colonii (mutante, revertante). Dacă substanţa nu este mutagenă în mediu se dezvoltă un nr. mic de colonii (mutante, revertante). Pentru a testa dacă substanţa devine cancerigenă după metabolizare în ficat se pretratează mediul de cultură cu extract de ficat.

43. Fig. TestAmes. a.Negative nemutagen; b. pozitiv- mutagenMediile conţin substanţe carcinogene

44. Mutaţii somatice şi germinative • Efectul unei mutaţii este diferit atunci când această mutaţie afectează ADN unei celule somatice sau a unei celule din linia germinală. • Atunci când ADN-ul unei celule somatice este modificat şi când rezultă o mutaţie, celulele care iau naştere din aceste celule mutante formează o clonă celulară, care prezintă caractere diferenţiate de cele ale ţesutului de origine. Astfel, de clone structurează adesea tumorile canceroase. Mutaţiile somatice nu sunt transmise la descendenţi. • Dacă ADN unei celule germinale este modificat şi rezultă o mutaţie atunci aceasta se va transmite la gameţi şi va apare la descendenţi: mutaţia este deci ereditară.

46. Activitatea unui situs criptic de episaj • În afara zonelor de episaj normal există situsuri criptice care pot fi active. Pot fi situate în exon producându-se episaj anormal al exonului sau în intron, o porţiune din intron, regăsindu-se în paralel, în produsul transcris matur. Cel mai adesea apare un codon STOP în aval. • O substituţie, poate altera un situs de legare. Astfel, situsul donator a intronului 3 a apoAII este transformat din GT în AT într-o familie de bolnavi, ceea ce-l face inactiv pentru excizia acestui intron.

47. Există în mijlocul exonului 3, o secvenţă care poate servi ca situs donator alternativ dar, care este în mod normal inactiv (situs donor criptic). În absenţa situsului donator normal, acest situs criptic va servi la excizia intronului 3. • Dar cum acest situs criptic este situat la 65 nucleotide în amonte de acest situs normal, vor exista 22 aminoacizi ai exonului 3 care nu vor fi traduşi. • Pe de altă parte numărul de nucleotide pierdute nefiind un nultimplu de 3, va avea loc un decalaj al cadrului de citire, cel care antrenează o traducere falsă a primilor 10 aminoacizi ai exonului 4 şi întâlnirea unui codon STOP prematur (Fig. 80). • Proteinele întrerupte nu se exprimă şi apolipoproteinemia AII este absentă din plasma acestor bolnavi.

49. Deleţia • Deleţia este excizia unui segment ADN. Acesta poate avea de la câteva nucleotide în secvenţa primară a unui acid nucleic. la mai multe milioane de baze (2-5 MB) sau chiar un cromozom. • Deleţia are importanţă variabilă în funcţie de lungimea lor: • de la 1 la 2 nucleotide ele decalează cadrul lecturii; • a 3 nucletotide, duce la absenţa unui codon şi deci supresia (lipsa) aminoacizilor în proteinele exprimate; • mai mari, ele pot suprima expresia uneia sau mai multor exoni sau a genei în întregime.