ECOLOGIA MOLECULAR DE SISTEMAS GASTROINTESTINALES ANTECEDENTES: Es una necesidad conocer la ecologia gastrointestinal:

1. ECOLOGIA MOLECULAR DE SISTEMAS GASTROINTESTINALES • ANTECEDENTES: • Es una necesidad conocer la ecologia gastrointestinal: • *Comunidades que aloja • *tamaño de ella • *Immpacto que pueden tener sobre el animal

2. METODOS USADOS PARA IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR POBLACIONES MICROBIALES • INDIRECTOS: • Técnicas microbianas: • * aislamiento de cultivos • * Selección • Desventajas: • *solo se especula sobre la población • *puede elegirse un método no muy adecuado para la • población es estudio. • *se basa en características fenotípicas

3. DIRECTOS • . Han demostrado que existen diferencias fisiológicas en colonias con caracteristicas geneticas similares, como un reflejo de evolución. • *TECNICAS MODERNAS • . Se basan en la comparación de secuencias homologas de biopolimeros(acidos nucleicos) • .se hace en base a una tarjeta de secuencia de RNA O DNA. • ventajas: • *provee información especifica del medio ambiente que representa la población • microbial. • * Permite hacer una clacificación mas acertada de los microorganismos.

4. BENEFICIOS *Ha generado información que permite comprender mejor el sistema microbial natural. *Provee una descripción completa de las comunidades microbiales complejas.

5. Análisis de las bases Ácido-nucléicas de los ambientes gastro intestinales • Problemas para ecologistas ruminales • -Falta de clasificación filogenética • -Técnicas de cultivo • Bacteroides, especies abundantes • Definición por Cato y Salmon (1976): • Gram negativo • Anaeróbico • No móvil • No espora • Ovalado • Fermentación de CHO’s • Producción de Succinato • Genética - 10 géneros - Fibrobacter Antecedentes Microbios del tracto GI, tipificados Diversidad Complejidad -Interacciones Interrelaciones: Comunalismo Mutualismo Competición Depredación

6. Antecedentes • Otros problemas con la técnicas de cultivo • Vogels (1980)Ecología de metanógenos asociados con superficies de protozoarios ciliados. • Krumholz (1983) Única función relacionada con el acarreo de hidrógeno y carbono. • Finlay (1994) Es necesario investigar esta relación a fondo.

7. Antecedentes • Limitado conocimiento de ecología de metanógenos • Limitado conocimiento en la relación Bacterias sulfato-reductoras (SRB) y metanógenos. • Reconocida desde 60’s y 70’s. • La mayor investigación hasta 1994 (Morvan) con relaciones entre ARB y metanógenos en la rumia. • Mayoría de estudios en humanos en I.G. • Enfatizan la necesidad de estudiar relaciónes - dieta. actividad microbiana y enfermedades humanas.

8. Antecedentes • Problemas asociados a enumeración en cultivos. • Investigaciones d ecología • Tazas de degradación y productos de formación. • Otras interacciones, deducidas de: • Características fisiológicas • Aislamientos de cultivos puros • El entendimiento completo de la ecología, debe ser con combinación de técnicas ya establecidas y técnicas moleculares.

9. Antecedentes • En ecología microbiológica molecular es necesario distinguir entre: • Identificación • Cuantificación • Monitoreo de funciones o actividad • También separar: • Métodos de identificación que requieran • Aislamientos de cultivos puros • Técnicas para identificar miembros de una comunidad.

10. Antecedentes • Métodos cuantitativos • Enumeración de células sencillas que acarrean ac. nuc. blanco • Cuantificación de poblaciones (cuantificación total de población de DNA o RNA • Definir métodos específicos de conteo • Ej. Presencia de gen metabólico particular, indica la potencial degradación de cierto compuesto, pero no ofrece información de la viabilidad del organismo o la expresión de dicho gen. • La información de análisis de N-A.B depende del tipo de ac. nuc. blanco y el marco técnico y conceptual del diseño de la prueba.

11. Antecedentes • Análisis de bases nucléicas de ecología microbial • Más de una década (1985). • Pocos estudios empleando hibridación de ac nucléicos en ecología GI. • Gran número de estudios de pruebas de ac nuc. En detección de patógenos. • Durante los últimos 10 años, nuevas investigaciones en ecología microbiana molecular • Pero no han sido aplicadas a ambientes de GI. • Pueden tener un uso potencial.

12. Antecedentes • Monitoreo de actividad promedio de poblaciones microbianas. • Cuantificación de rRNA, después de extracción de RNA (1991, 1993). • Monitoreo de genes de expresión (1993). • Detección In situ de genes de expresión en células simples. • No funcionan para signos cuantitativos.

13. Antecedentes • Desarrollo de Bioluminiscencia (1991). • Fusión de genes “Flux” en organismos “indígenas” • Reintegración de organismos modificados en ambiente • Monitoreo no destructivo de transcripción genética • Desventajas, requiere oxígeno para luminiscencia • No puede ser combinada con hibridación de rRNA blanco, por la pérdida de luminiscencia en la fijación celular.

14. Antecedentes • Procedimientos de fijación (1995) • Optimizados para mantener la actividad de β -galactosidasa después de la fijación • Sustratos cromogénicos β –galactosidasa evaluados por su capacidad para precipitar colores después de la fijación. • Cámara y software de análisis de imágenes. • Cuantifica la intensidad de fluorescencia y la actividad de β –galactosidasa debido a los niveles rRNA dobles.

15. Antecedentes • Marcadores para genes de expresión (GFP) 1994. • Flourescen después de fijación y compatibles con hibridaciones de rRNA blanco en células completas • Evaluar varios parámetros simultáneos

16. Métodos Basados en DNA • Salyers y colaboradores (1985): • Técnicas de ácidos nucleicos usadas por primera vez para cuantificar poblaciones bacterianas del TGI (Kuritza y Salers, 1985). Sondas específicas de DNA (Clonado aleatoriamente, fragmentos de DNA identificados por radiación de .4 a 2.5 kb). Extracción de DNA de bacterias en heces de humanos Para cuantificación de: Bacteroides vulgatus y B. Thetaiotaomicron.

17. El nivel de detección fue bajo como para permitir el uso de técnicas basadas en cultivos, sin embargo permitió la diferenciación entre especies que no eran distinguibles con pruebas bioquímicas. • Metodología similar, (Attwood et al. 1988): • Cuantificación de Bacteroides ruminicola subs. brevis en líquido ruminal (2 x 107 células/ml).

18. Sondas de DNA • También usadas para investigar diversidad de especies. • Uso reducido comparada con ARN (por la alta probabilidad de hibridación cruzada).

19. Flint et al. (1990): • sonda del gen codificador de celulasa de Fibrobacter succinogenes reveló polimorfismos de fragmentos restringidos entre cepas de esta especie. Se encontró alta divergencia interespecies. Fragmento de DNA codificador de celulasa Cepa A Cepa C Cepa B Polimorfismos de fragmentos restringidos

20. Lin (1993), analizó 15 cepas de Fibrobacter y encontró: 94 % de homologia con DNA 99.8% de homología con 16 rRNA Menos variación entre las cepas

21. Métodos basados en RNA • Análisis comparativo de la secuencia de pequeñas subunidades de rRNA (16S rRNA) • En el futuro se utilizará la subunidad 23S rRNA • Análisis de la secuencia de las moléculas de la subunidad 16S rRNA, en una amplia variedad de microorganismos reveló que se presentan varias “regiones” que varían en la “conservación” de la secuencia

22. Dichas “regiones” de la molécula del 16S rRNA han permitido el desarrollo de sondas de hibridación de oligonucleótidos generales y específicas • Oligonucleótidos que complememntan regiones de secuencia de 16S r RNA universalmente conservadas: Para cuantificar 16S r RNA de cualquier fuente (Prueba Universal) Generales Oligonucleótidos que complementan regiones que varian en secuencia (p.e. microorganismos específicos) Utilizadas en sondas selectivas ( de especie, género o grupo filogenetico) Específicas

23. Análisis de comunidades microbiales basados en 16S rRNA implica: • Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos • Colanación y secuenciación de la información de 16S rRNA obtenida directamente de las muestras. • Comparación de la secuencia obtenida con una base de datos de secuencias de microorganismos previamente obtenidas • La comparación sirve para dar un lugar a nuevas secuencias en la clasificación filogenética

24. Uso del Fibrobacter como un Organismo Modelo para Desarrollar Técnicas Basadas en RNAr • Sondas de oligonucleótidos específicas de la 16S RNAr (cepas de F. Succinogenes y Lachnospira multiparus) • Los cambios en los niveles de 16S RNAr, se monitorearon exitosamente • No fue exitoso con el uso de agar para F. Succinogenes • Los resultados demostraron la habilidad de la prueba para monitorear poblaciones abundantes o cambios en la actividad.

25. La creación del nuevo género fibrobacter se facilito por la secuencia comparativa de 16S RNAr. • La secuencia comparativa de 6 cepas de B. Succinogenes • El análisis de la secuencia combinado con características fenotípicas (2 subespecies: F. Succinogeges y F. Elongata) • Aislamiento del rumen, también del intestino y del colon • Cepas fenotípicamente igual, pero filogenéticamente diferente (F. Intestinales) • La información secuencial del 16S RNAr de 6 cepas de fibrobacter (F. Succinogenes y F. Intestinales) • Utilidad de emplear sondas de diferente especificidad

26. Materiales y Métodos • Sintesis y marcacion de Oligonucleotidos. • Extraccion de Acido Nucleico. • Hibridacion de Membrana.

27. USO DE METODOS A BASE DE rRNA PARA ESTUDIAR LA ECOLOGIA Y SISTEMA DE OTRAS POBLACIONES BACTERIANAS EN EL MEDIO DE TRACTO GASTROINTESTINAL • Los analisis comparativos de 16S rRNA fueron desarrollados y refinados con la ecologia de fibrobacter • Ha servido para: • Asignar familias a generos • Especies a generos i.e. Ruminococcus (R. albus, R. Flavefaciens y R. Callidus) • Interaciones entre micooorganismos

28. Prevotella ruminicola • Se observo que existe una gran diversidad genetica en las diferentes cepas de P. Ruminicola, por lo que de ahí se pueden formar tres nuevas spps. • Tambien se han realizado estudios con el E. Coli BJ4 para estudiar su distribucion, tiempo generacional, distribucion, etc.

29. Uso De Métodos Basados En rRNA Para Caracterizar Y Cuantificar Poblaciones Protozoarias Y Fungicas En Ambientes Del Conducto Gastrointestinal • Número limitado de estudios • Ejemplo Prueba de oligonucleótidos específicos de Archaea con niveles de flouroesencia • Protozoos ciliados comunes (2) • Especies de Entodinium y Dasytricha ruminantium • 96 y 520 Archaea en promedio respectivamente - Citoplasma

30. Polimorfos del metanogenico Methano corpusculum parvum • 18S rRNA análisis – posición taxonómica del Neocallimastix (Microorganismo anaerobio importante) • Más cercanos a Chytridiomycetes (Basidiomycetes, Ascomycetes y Chytriodiomycetes)

31. Uso de métodos basados en rRNA como monitor en las relaciones de poblaciones microbianas en los ambientes del conducto Gastrointestinal • Pruebas de Oligonucleótidos 16S rRNA • Medios más sensitivos que DNA • Bacterias degradadoras de piridinediol (Synergistes jonesii) • Niveles radiactivos para niveles bajos • Métodos probablemente aplicables a especies silvestres • Relaciones Filogenéticas entre cultivos colectados y su rol en el ambiente, se asume una aplicación limitada

32. Problemático para Manipulación genética o transferencia de genes • Reintroducción de cepas de laboratorio en ecosistemas microbiales fallidos • Exclusión competitiva por relaciones de poblaciones residentes • Ejemplo E. coli • Uso de pruebas rRNA como objetivo • Instrumento en la asistencia en el conocimiento de la colonización • Evaluación de diferentes estados fisiológicos

33. En Estudios futuros: • Mayor uso de mediciones explícitas • Pruebas de rRNA • Caracterización de eventos de Colonizacion y Exclusión

34. Caracterización y Propósito de las sondas de los Oligonucleótidos Evaluación de doble estabilidad Evaluación de sonda especifica

35. Evaluación de doble estabilidad Tm = Temperatura de fusión. Td ó Trd = Teperatura de disociación ó temperatura de doble retención. Temperatura de lavado de hibridación = Td. Evaluación de sonda específica Uso de sondas blancas de rRNA. Búsqueda de blancos y noblancos (BANCOS). Número de sondas probadas. Sondas “animados” Inspeccionando ambientes diferentes ce complejidad comparable.

36. Caracterización y Propósito de las sondas de los Oligonucleótidos Análisis secuencial comparativo de las moléculas rRNA ha servido como propósito de la sonda para la fundación oligonucleótidos. Esto ha traído como resultado un número sustancial de publicaciones que describen el propósito de sondas de hibridación de oligonucléotidos en general y específicos (Ver tabla 7.1 resumen de sondas potenciales interés desarrollados en los estudios de ecología microbiana del tracto gastrointestinal. La mayoría de estos estudios siguen el acercamiento de caracterización y propósito de sonda descritos en detalle por Stahl y Amann (1991). Esta sección presenta varios consideraciones adicionales contra el respecto de la caracterización y propósito de la sonda de los oligonucleótidos que ninguno ha sido todavía explícitamente discutido.

37. Evaluación de doble estabilidad. Parámetro importante para el contexto del uso del blanco en las hibridaciones cuantitativas de la sonda rRNA es la temperatura de fusión (Tm). La Tm para oligonucleótidos, se define, como la temperatura de equilibrio los oligomeros a que medio se disocian.(Stahl y Amann 1991, Tijseen 1993). La temperatura de disociación (Td) o temperatura de la doble retención (Tdr) definido como el punto medio de temperatura de la transición entre la doble estructura (los oligonucléotidos limitaron a la sucesión complementaria) y el blanco disociado dejado-solo, no corresponde a las condiciones de equilibrio y por consiguiente pueden ser diferente a la Tm.

38. La temperatura de lavado de hibridación, es un parámetro importante experimental y generalmente es igual Td. El valor de Td esta dada por la estabilidad de la sonda-blanca doble de los oligonucleótidos y concecuentemente, depende de la longitud de la sonda y composición del nucleótido, estructura del alto-orden en la región de sucesión designado y las condiciones de hibridación (temperatura y tiempo de hibridación, la concentración de sal del buffer de hibridación, sonda de concentración, etc.). Aunque empíricamente derivado de las relaciones (Stahl y Amann 1991, Tijsenn 1993) se habían desarrollado para estimar el valor Td, ellos no incorporaron todos los parámetros y, por consiguiente, se recomendaba para definir la hibridación y condiciones del lavado experimental para cada nueva sonda (Stahl and Amann 1991, Raskin et al. 1994b). Esto es especialmente cuando se usan sondas para diferenciar entre blancos que difieren en sólo unos nucleótidos (Ver Sección 4.2).

39. Aunque la determinación experimental de valores de Td es altamente recomendado, empíricamente derivado relacionado para estimar el valor Td debe usarse a priori durante el proceso del propósito de la sonda. Es a menudo posible alterar el valor predecidó de Td marcando por una sonda más larga o más corta (aunque el propósito de la sonda no siempre permite mucha flexibilidad). Obviamente, la especificidad de la sonda no debe comprometerse durante este proceso. Cuando se esta usando sondas múltiples para determinar la abundancia/actividad de poblaciones múltiples en la misma muestra, es preferible diseñar un juego de sondas con valores de Td que están relativamente cerca o cerrados de cada uno. La disponibilidad de sondas con valores similares de Td es principalmente una materia de convivencia experimental al emplear las membranas de hibridizaciones. Sin embargo, cuando las sondas múltiples son usadas simultáneamente en hibridaciones de células enteras (las señaladas por (Amann et al. 1990a) o designado a las poblaciones diferentes), pueden las condiciones de hibridación perfeccionarse para todas las sondas involucradas sólo si sus valores de Td son muy similares.

40. 4.2 Evaluación de sonda específica. Especificidad de las sondas es un propósito esencial de consideración cuando se usan sondas blancas de rRNA para la cuantificación de abundancia población y actividades en comunidades microbianas natural, que potencialmente albergan a nuevos microorganismos. Bajo la apropiada hibridación y condiciones del lavado (relativamente alta estrechez), es a menudo diferenciar entre blancos que difieren a un solo nucleotido (Stahl y Amann 1991). Sin embargo, desde la posición y composición de una desigualdad entre la sonda y la influencia designado por magnitud de la hídrido destabilización (para una revisión vea Stahl y Amann 1991) y no hay una regla adecuada para predecir estabilidad híbrida basado en la sucesión, todavía es necesario evaluar la especificidad de nuevas sondas experimentalmente.

41. La evaluación de especificidad de sonda generalmente empieza con una búsqueda de blancos y no blancos usando complementariamente grupos que usan bancos de datos de sucesión de rRNA [Banco Ribosomal Datos Proyectos (RDP), Maidak et al., 1994) y la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica Local alineación búsqueda Herramienta (BLAST), servicios network (Altschul et al. 1990)]. Si algunas especies designados intencionalmente tienen un número pequeño de desigualdades sola entre la sonda y la suceción del rRNA correspondiente, puede ser posible bajar la hibridación y lavado estreches para incluir el signo de hibridación contribuidos por estos microorganismos. Sin embargo, haciendo esto, la hibridación a las especies de noblanco con un número pequeño de desigualdades puede componer especificidad de la sonda. Por consiguiente. Las búsquedas del banco de datos son esenciales identificar desigualdades en noblancos y especies del blanco. Obviamente, estas búsqueda sólo son tan buenas como los bancos de datos y desde que más sucesiones del rRNA están poniendose disponibles rápidamente, la caracterización y el propósito de la sonda es un proceso dinámico que necesita evaluación constante.

42. Una evaluación de especificidad de la sonda experimental involucra el número de sondas probadas contra un número relativamente grande de número blanco y especies de noblancos que usan la hibridación determinada y estreches del lavado experimentamente (Devereux et al. 1992, Manz et al. 1992, Raskin 1994b, Wagner et al. 1994). La selección del juego de estudio del organismo y resultados de hibridación debe ser interpretada usando la información obtenida de las búsquedas del banco de datos. Como evaluación de especificidad de la sonda experimental se ilustra blanqueand o aquí los 16S rRNA de fibra-digerir microorganismos de importancia en herbívoros RECLUTA tractos ambientales. Una sonda circunscribe el género Fibrobacter (sonda S-G-Fibr-0225-a-A21 Tabla 7.1), mientras un segundo blanco de la sonda el Fibrobacter intestinalis (sonda S-S-F.int-0136-a-A20 Tabla 7.1) Además una sonda universal (sonda S-*-Univ-1392-a-A-15, Tabla 7.1), blanquendo los 16S rRNA de todos los organismos conocidos, se usó virtualmente. La especificidad de estas tres sondas se probó contra la colección de 80 referencias que

43. extrajo RNAs de Eccarrya, Archea, y Bacterias. Sesenta y 65 organismos de noblancos (devereux et al. 1992) y 15 Fibrobacter fatiga, los que eran representativos de la diversidad de Fibrobacter conocida y para que 16S sucesiones del rRNA habían sido previamente determinadas (Montgomery et al. 1988) (Lin et al. 1994). Las muestras de RNA se aplicaron a las membranas de Immobilon-N, y la hibridación se realizó anteriormente describiendo. Plantilla de una de las membranas así como se muestra autoradiográfos de las tres membranas hechos en la Figura 7.2. Este experimento de la especificidad de la sonda se ha demostrado excelentemente: la sonda que hizo híbrido fuertemente a los 16S rRNA de los organismos designado y no hizo híbrido a las sucesiones de noblancos. La sonda específica-género (S-G-Fibr-0225-a-A-21) hizo híbridación a los 16S rRNA de todo las tensiones de Fibrobacter aplicados a la membranas, mientras la sonda especie- específica para F. Intestinalis (S-S-F. int-036-a-A-

44. 20 ) sólo hizo hídrido a los cinco F. Intestinales fatigan. Estos autoradiografos también permiten estimaciones de hibridización de fondo señale para las muestras del noblancos. Los signos de hibridación de fondo estaban significativamente menos de 1% del signo de hibridación de muestras designando (Lin et al. 1994). En un estudio más temprano que usó la misma colección de refrencia RNAs para probar la especificidad de una colección de sondas para SRB la media hibridación del por ciento de muestras del noblanco varió de 0.1 a 0.4 % (Devereux et al. 1992). Si una búsqueda del banco de datos indica que estas suceciones del noblanco tienen sólo alguno desigual con una sonda particular, el quatificación preciso de hibridación del fondo es extremadamente importante. Por otro lado, desde la diversidad grande actualmente representada en 16S bancos de datos de rRNA no es simultaneamente presentan en una sola muestra medioambiental, pueden exagerarse las preocupaciones anteriores de hibriación del fondo.

45. Una segunda estrategia importante que puede usarse para probar la especificidad de la sonda experimentalmente es el “animado” de sondas. Subsecuentemente los grados diferentes de conservación en sucesiones del rRNA permite el propósito general y la hibridación de los oligonucléotidos sondeo , varias sondas con niveles del incremento de especificidad (e, g., familia-, género-, y las sondas especie-específica) puede usarse para caracterizar un solo ambiente. Si cada juego de sondas abarca la diversidad completa de especies designado presente en una cierta muestra, el de la suma de las cantidades de 16S rRNA cuantificada por un juego de sondas específicas (e.g., sondas especie-específicas) debe igualar la cantidad determinadapor una sonda más general (e.g., sondas genero-específicas). Así, la consistencia entre la hibridación produce un aumento a las sondas general y específico la confianza la selectividad del blanco-grupo y la integridad de nuestra comprensión de diversidad natural dentro de la reunión designado general.

46. Uso de Sondas para identificar nuevas poblaciones • Los incosistentes resultados de hibridación usando sondas generales y específicas indican que por lo menos una sonda carece de especificidad.

47. Alternativamente... • Existe la posibilidad de que residuos de especies no cultivadas relacionadas a la sonda del grupo blanco no puedan ser detectadas por una o más de los juegos de sondas.

48. Por ejemplo: • Si el uso de la sonda general indica que hay una cantidad significativa de el grupo blanco presente en una muestra del medio ambiente que no es cuantificada por la combianción de varias pruebas específicas, entonces se dice que hay una nueva población.

49. Evaluación de la diversidad de Fibrobacter • Se usaron 6 sondas de Fibrobacter • Se reveló que la F. Succionógenes fué la única (cuantitativamente) importante de las especies de Fibrobacter presentes en el intestino del ciego de un pony.

50. Sin embargo... • El uso de tres sondas de subespecies de F. Succionógenes demostraron que ninguna de éstas estaba presente en forma cuantitativa... • Por lo que las F restantes, podría decirse que eran una nueva población.