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第四章 药物的含量测定方法与验证

第四章 药物的含量测定方法与验证. 定量方法特点：. 第一节 定量分析方法的分类与特点. 一、容量分析法 （一）容量分析法的特点 操作简单、快速； 比较准确（ RSD ＜ 0.2% ）； 仪器普通易得。. （二）容量分析法的有关计算. 1. 滴定度（ T ）的概念 每 1ml 滴定液相当于被测物质的量 (mg) 2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dD T = M × a/b × B 3. 百分含量的计算（原料药）

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第四章 药物的含量测定方法与验证

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  1. 第四章 药物的含量测定方法与验证

  2. 定量方法特点：

  3. 第一节 定量分析方法的分类与特点 一、容量分析法 （一）容量分析法的特点 操作简单、快速； 比较准确（RSD＜0.2%）； 仪器普通易得。

  4. （二）容量分析法的有关计算 1. 滴定度（T）的概念 每1ml滴定液相当于被测物质的量(mg) 2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dD T = M×a/b×B 3. 百分含量的计算（原料药） （1）直接滴定法 D% = V ×F × T/W ×100% F = 实际浓度/规定浓度

  5. （2）剩余滴定法 T——滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数 V——滴定时，供试品消耗滴定液的体积（ml） V0——滴定时，空白消耗滴定液的体积（ml） F——浓度校正因子 ms——供试品的质量

  6. 双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml与甲基橙3滴，用0.1062mol/L盐酸滴定，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积21.05ml。计算样品中苯甲酸钠含量。苯甲酸钠分子量144.1。双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml与甲基橙3滴，用0.1062mol/L盐酸滴定，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积21.05ml。计算样品中苯甲酸钠含量。苯甲酸钠分子量144.1。

  7. 司可巴比妥的含量测定：取供试品0.1301g，置碘量瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.1mol/L)25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1min，暗处静置15min后，加碘化钾试液10ml，立即密塞摇匀，用0.0999mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液15.05ml，空白消耗25.05ml，每ml溴滴定液（0.1mol/L)相当于13.01mg的司可巴比妥。计算含量司可巴比妥的含量测定：取供试品0.1301g，置碘量瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.1mol/L)25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1min，暗处静置15min后，加碘化钾试液10ml，立即密塞摇匀，用0.0999mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液15.05ml，空白消耗25.05ml，每ml溴滴定液（0.1mol/L)相当于13.01mg的司可巴比妥。计算含量

  8. 片剂含量测定结果的计算

  9. 烟酸片含量测定 取本品10片精密称定为3.5840g，研细，精密称取0.3729g，置100 mL锥形瓶中水浴加热溶解后，放冷。加酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1005mol/L)滴定至粉红色消耗25.02 mL。每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当12.31mg的烟酸。求供试品中烟酸的标示百分含量（标示量0.3g/片）。

  10. V × T × F ×平均片重 ×100 % 标示量%= W ×标示量 25.02 ×12.31/1000 ×0.1005/0.1×0.3584 = ×100 % 0.3729 ×0.3 = 99.17%

  11. 二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm) 灵敏度高，可达10-7g/ml ～10-4g/ml 1. 特点 准确度高，RSD（%）< 2% 仪器价格低廉操作简单，易普及，应用广 2. 定量：朗伯-比耳定律 A = E1%1cmCl

  12. 3. 仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73, 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm 或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。 吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml 波长(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大) E1%1cm 124.5 144.0 48.62 106.6 杂散光检查： 试剂 浓度(g/ml) 测定波长 透光率(%) NaI 1.00 220nm ＜ 0.8 NaNO2 5.00 340nm ＜ 0.8

  13. 4. 对溶剂的要求: 220～240nm 241～250nm 251～300nm 300nm以上 溶剂+吸收池A ＜0.40 ＜0.20 ＜0.10 ＜0.05 5. 测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 ～0.7 对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=Cx×D/W×100 % 常用方法 吸收系数法： 含量%= (E1%1cm)x/(E1%1cm)r ×100 % 计算分光光度法：VitA的三点校正法 比色法

  14. 硫喷妥钠的含量测定：取供试品0.2500g，用水稀释至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀释至100ml，作为供试品溶液；另取硫喷妥对照品用0.4%NaOH溶液配制浓度为5.0µg/ml作为对照品溶液。照分光光度法，在304nm波长处分别测得供试品和对照品的吸收度为0.520和0.545，已知1mg硫喷妥相当于1.091mg的硫喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量硫喷妥钠的含量测定：取供试品0.2500g，用水稀释至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀释至100ml，作为供试品溶液；另取硫喷妥对照品用0.4%NaOH溶液配制浓度为5.0µg/ml作为对照品溶液。照分光光度法，在304nm波长处分别测得供试品和对照品的吸收度为0.520和0.545，已知1mg硫喷妥相当于1.091mg的硫喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量 对照品比较法

  15. （2）吸收系数法

  16. 对乙酰氨基酚的含量测定方法为 精密称取本品40.1mg，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀。在257nm的波长处测定吸收度为0.570，按C8H9NO2的百分吸收系数为715计算。

  17. （二）荧光分光光度法 灵敏度高，可达10-12g/ml ～10-10g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用 1. 特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。 制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。 用样品量少。

  18. 2. 荧光分析仪 有二个单色光器—激发单色光器与发射单色光 • 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。 • 含量测定 常用的方法为对照品比较法: • Cx = (Rx-Rxb)/(Rr-Rrb) ×Cr • Ch.P2010收载利血平片

  19. 三、色谱分析法 色谱分析法的特点与适用范围 高灵敏度，可达10-15g/ml ～10-12g/ml 高专属性，强分离能力 高效能，可多组分同时定量分析 色谱法分类： PC；TLC；柱色谱；GC，HPLC 高相液相色谱法分类：吸附；分配；离子交换；排阻色谱等。

  20. 高效液相色谱仪

  21. 色谱柱 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用 正相HPLC：极性填充剂，弱极性流动相 反相HPLC：固定相极性小于流动相极性，大多C18柱、甲醇、乙腈、水（缓冲液）作流动相。一般色谱柱使用温度不超过40℃，流动相pH控制在28之间。

  22. 检测器 作用—— 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 目前最常用的检测器主要有： 紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器

  23. 二极管阵列检测器色谱图 常规色谱图 三维色谱图 光谱图

  24. 1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系统性试验 分离度：R = 2（tR1 – tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 重复性：RSD≤2% 拖尾因子：T = W0.05h/2A 应在0.95 ～ 1.05

  25. 正常峰和不正常峰如何判断？ 用拖尾因子（对称因子）：T T= W0.05h/2A

  26. 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 AX CR 含量= × AR 外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量 前提：截距接近0，对照品浓度与待测组分浓度接近

  27. 对内标物要求： a．内标物须为原样品中不含组分 b．内标物与待测物保留时间应接近且R>1.5 c．内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质 内标法： AS/CS AX 校正因子（f）= 含量（CX）=f AR/CR A’S/CS’

  28. 内标法优点： 进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响 只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 。 内标法缺点： 制样要求高；须寻找合适内标物

  29. 外标法特点： 1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰 2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大 →每次进样量应一致，否则产生误差

  30. 例：醋酸氢化可的松的含量采用HPLC法测定：取本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每ml约含0.35mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液（0.30mg/ml炔诺酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样为36.2mg，样品取样为35.5mg，测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品液中药物和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计算本品的含量

  31. 概述 含金属与卤素药物须处理后进行测定。处理方法视结合牢固程度而异。卤素与芳环相连牢固；与脂肪族碳相连，结合不牢固。 含金属药物：金属不直接与碳相连为含金属的有机药物，不牢固，一般直接测定；金属与碳相连为有机金属药物，须适当处理。 第二节 定量分析样品前处理方法 • 不经有机破坏的分析方法 • 经有机破坏的分析方法

  32. 1、直接测定法 金属元素不直接与碳原子相连的含金属有机药物或C-M键结合不牢的有机金属药物，在水溶液中可电离，不须破坏直接采用适当的方法测定 如葡萄糖酸钙中的钙离子-EDTA络合滴定 一、不经有机破坏的分析方法

  33. 2、经（酸、碱）水解后测定法 方法原理（卤素）：将含卤素的有机药物溶于适当溶剂中，加氢氧化钠或硝酸银溶液加热回流使其水解，将有机结合的卤素，经水解作用转变为无机卤素离子，然后采用间接银量法测定。如三氯叔丁醇的测定。 间接银量法：定量加入过量的AgNO3，过量的硝酸银以硫氰酸铵为滴定剂，硫酸铁铵为指示剂滴定。

  34. CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH 回流 (CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O △ NaCl+ AgNO3 AgCl↓+ NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN ↓ + NH4NO3 Fe3+ + SCNˉ Fe (SCN) 2+ (Ksp=1.56×10–10 ) (Ksp=1.0×10-12 ) （淡棕红色）

  35. 3、经还原后测定法 碱性还原后测定 方法原理；在氢氧化钠和锌粉存在的条件下，有机药物（多用于含碘有机药物）加热回流，发生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤素离子（碘离子），继而采用间接银量法或其他方法进行测定，如泛影酸的测定。 适用范围：碘原子与苯环直接相连的药物。

  36. 例 泛影酸的测定 取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。

  37. C O O H I I + 11NaOH + Zn H C O C H N N H C O C H 3 3 I C O O Na 回流 + 3NaI + 2CH3COONa △ H2 N N H2 + 2Na2ZnO2 + H2O

  38. 酸性还原后测定法 方法原理；在醋酸和锌粉存在的条件下，有机药物（多用于含碘有机药物），发生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤素离子（碘离子），采用银量法测定卤素离子的含量。

  39. 二、经有机破坏的分析方法 （一）、湿法破坏 硝酸-高氯酸法：破坏能力强，反应激烈，需防止爆炸。适用于生物样品的破坏，所得的无机金属离子为高价态。 硝酸-硫酸法：适用于与碳原子结合牢固的绝大多数含金属有机药物的破坏分解（但不适用于含碱土金属类有机药物），所得的无机金属离子为高价态。 硫酸-硫酸盐法：常用的硫酸盐为硫酸钾，所得的无机金属离子为低价态。常用于含砷或锑有机药物的破坏分析。

  40. 凯氏定氮法-含氮有机药物定量分析方法 原理：常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后用标准无机酸滴定，最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。

  41. CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH32NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 +2NaOH 2NH3+H2O+Na2SO4 NH3+H3BO3 NH4BO2+H2O NH4BO2+H2SO4+2H2O (NH4)2SO4 +2H3BO3（直接滴定法） 还可用剩余滴定法或甲醛法滴定

  42. 消解剂：硫酸消解时通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。对某些难以分解的药物（如含氮杂环结构药物），在消解过程中常还需加入辅助氧化剂，以使分解完全并缩短消解时间。常用的辅助氧化剂有过氧化氢和高氯酸，但需慎用。消解剂：硫酸消解时通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。对某些难以分解的药物（如含氮杂环结构药物），在消解过程中常还需加入辅助氧化剂，以使分解完全并缩短消解时间。常用的辅助氧化剂有过氧化氢和高氯酸，但需慎用。

  43. 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。 常量法取供试品的量约相当于含氮量25~30mg 半微量法供试品取样量约相当于含氮量1.0~2.0mg

  44. 中国药典用本法测定含有氨基或酰胺结构的药物含量。对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，须在消解前加锌粉还原后再依法处理；而杂环中的氮因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解。对于含氮量较高的样品（超过10%），可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨。中国药典用本法测定含有氨基或酰胺结构的药物含量。对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，须在消解前加锌粉还原后再依法处理；而杂环中的氮因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解。对于含氮量较高的样品（超过10%），可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨。

  45. （二）、干法破坏 1、高温炽灼法 将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品置于瓷坩埚或铂坩埚中，加入无水碳酸钠、氢氧化钙或轻质氧化镁等以助灰化，混匀后，先小火加热使样品完全炭化，然后高温灼烧，使其完全灰化。 本法适用于湿法不易破坏完全的药物以及不能用硫酸进行破坏的有机药物。

  46. 2、氧瓶燃烧法 系指将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别，检查或含量测定。

  47. 适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析 本法简便、快速、破坏完全，尤其用于微量样品分析

  48. 基本原理 有机物 充O2烧瓶 燃烧 产物 吸收液 →分析 仪器装置和设备 （1）燃烧瓶 （2）称样材料及称样方法：无灰滤纸：适用于固体；纸袋：适用于液体 （3）氧气：采用钢瓶氧气，防止导气管污染。 （4）吸收液：定量吸收供试品的燃烧分解产物，使其转变为便于测定的价态。

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