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许冰莹, Tel:0871-65922837；13769175605Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院

器官移植（Organ transplant） 将一个器官整体或局部从一个个体用手术方式转移到另一个个体的过程。目的:用供体的好的器官替代损坏的或功能丧失的器官，代偿受者相应器官因致命性疾病而丧失的功能。移植器官正象人的其他细胞一样，有二大类主要抗原：ABO血型和人类白细胞抗原(HLA)它们决定了同种移植的排斥反应。最大的问题：排斥反应。

第九章白细胞血型Blood type of White blood cell 概述（Summary）第一节HLA抗原（HLA Antigen）第二节 HLA命名（ HLA Naming）＊第三节 HLA遗传（HLA genetic）＊第四节 HLA分型（HLA typing）第五节 HLA的应用（ application of HLA）

第九章白细胞血型Blood type of White blood cell 教学内容和目的要求(Teaching contents and requirements)： 1.了解HLA的研究历史，HLA抗原结构及分布。了解HLA的命名，了解HLA的血清学分型。＊2.熟悉HLA的基因结构和遗传特征（ Master gene structure　ａｎｄ　 Geneticcharacteristics）＊3.掌握DNA分型原理和方法　（Master DNA ｔｙｐｉｎｇ　 principle and methodｓ）学时安排：理论课 3学时。

第九章白细胞血型Blood type of White blood cell概 述（Summary） H--- Human L--- Leukocyte A---Antigen

一.人类白细胞抗原的特点(The characteristics of HLA) 1.人类最复杂的显性遗传多态性系统(The most complexDominant genetic polymorphism system)2.人类基因组中基因密度最高的区域(The gene density is the highest region of the human genome ) A座位有13个基因，B座位有30个基因，组成的单倍型约有13×30＝390种之多。理论上估计，父母各给一串单倍型给子女，便会形成4.3万种HLA－AB 单倍型。

理论推测的HLA 分型数量巨大，但对每一个具体的民族来说并非如此。世界上各个民族人群的HLA多态性和单倍型都有各自的特点： 1.中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。 2.在中国， HLA多态性和单倍型在地区间也存在差异。需要解决的问题：群体遗传学调查。

二.HLA 系统功能(The HLA system function) 1.抗原的加工、呈递，控制免疫应答，调节免疫细胞间相互作用，对异体移植物的排斥，肿瘤监视，参与大量自身免疫疾病的发生等。 2.HLA多态性分析是法医学个体识别和亲权鉴定理想的遗传标记。（ ideal genetic markers inForensic individual identification and paternity identification ）

三.HLA基因（HLA gene） 位于6号染色体短臂，长约4000Kb。有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，呈共显性表达---共显性遗传。位于同一条染色体上，多基因座位上的基因型组合相对稳定，形成单倍型（HAPLOTYPE)---遗传特征。

＊单倍型（HAPLOTYPE) 在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合。（In the same chromosome linked to a range of allele Because of the special combination） HLA基因以单倍型为特征进行遗传--遗传特点

第一节HLA抗原（HLA Antigen） 一.人类白细胞膜上的抗原分为三类： 1.红细胞血型抗原：ABH、Lea、Leb、RhD等 2.白细胞本身特有的抗原：CD4，CD8、Leu8 等 3.人类白细胞抗原（HLA）：与其它组织共有的，最强的同种抗原，又可称为移植抗原、组织相容性抗原或组织抗原（tissue antigen）。

二.HLA研究历史(Research history) 自学（Self-taught）自学的内容和要求（Learning contents and requirements）：内容： HLA的研究历史要求：了解HLA的研究历史时间：1小时

三.HLA抗原结构及其分布（Structure and distribution of HLA antigen） HLA Ⅰ类和 HLA Ⅱ类抗原存在于细胞表面，跨膜蛋白质，异二聚体蛋白。 HLA Ⅰ类和 HLA Ⅱ类抗原分子的三级结构有很多相似之处。

1.HLA-I类抗原的结构（HLA-I antigen structure） HLA-Ⅰ类基因的产物为HLA-A、B、C抗原，由重链和轻链两条多肽链构成，两条链以非共价键相连接。

HLAⅠ类抗原

2.HLA-II类抗原的结构（HLA-II antigen structure） HLA-Ⅱ类基因产物为HLA-DR、DQ、DP抗原，跨膜糖蛋白，由α和β两条链构成。

HLA Ⅱ类抗原

3.HLA抗原的细胞分布（HLA antigen distribution of cell） HLA抗原主要存在于细胞膜上，不同细胞上的抗原分子多少不同。（1）HLA-Ⅰ类抗原：分布广泛，几乎存在于所有有核细胞表面，以淋巴细胞上的密度最高。 • 正常情况下，心肌细胞和肝细胞 HLA 抗原极少或没有。

（1）HLA-Ⅰ类抗原（HLA-I antigen ） • 成熟红细胞上没有HLA-A、B、C和DR抗原，幼稚红细胞有。 • 血小板除自身带有HLA-Ⅰ类抗原外，还可以从血浆中吸附可溶性 HLA 抗原。

（2） HLA-类抗原（HLA-Ⅱ antigen ）： 含有 HLA-Ⅱ类抗原的组织比Ⅰ类抗原少得多，密度最高者为树突状细胞、单核细胞，一些吞噬细胞亚群及 B 细胞。

第二节 HLA命名（Naming） 自学（Self-taught） 1.自学内容和要求（Learning contents and requirements）了解HLA的命名的原则。 2.时间：1小时。

第三节 HLA遗传（HLA genetic） 一.HLA基因定位与基因结构 (HLA gene location and gene structure) 定位于人类第6号染色体短臂(6p21.31)，参考序列全长 3.6Mb，占整个人类基因组全部碱基序列的 0.12%。 HLA区主要有:HLA-Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ类基因座。

一.HLA基因定位与基因结构 (HLA gene location and gene structure) 1.HLA-Ⅰ类基因（HLA-I gene） DNA片段为1600~2000kb，含有8个外显子和7个内含子，多态性主要由第2和第3外显子决定。（1） HLA-A、 HLA-B 和 HLA-C三个基因座：每个基因座编码经典Ⅰ类抗原的一条重链。（2） HLA Ib基因座：包括HLA-E、F、G和 H基因,编码Ⅰ类蛋白，与 A、B、 C基因座相比，多态性少。

一.HLA基因定位与基因结构 (HLA gene location and gene structure) 2.HLA-Ⅱ类基因(HLA-Ⅱ gene) DNA 片段长1000-1200kb,含有6个外显子和5个内含子。多态性主要由第2外显子决定。包括DR、DQ 和 DP 基因座，编码HLA-Ⅱ类区域的主要基因表达产物。

二.HLA遗传特征( Genetic characteristics) 1.共显性遗传(Codominant inheritance) HLA属常染色体共显性遗传，每个HLA基因座表达一对抗原，组成了个体该基因座的表型。人类HLA每个基因座上有众多等位基因，故多数个体是HLA杂合子。某个体的HLA-A座位检测出A1和A2抗原,该个体表型为HLA-A1，2。

二.HLA遗传特征( Genetic characteristics) 2.单倍型遗传（haplotype）人体细胞为二倍体型，两个单倍型分别来自父亲和母亲。由于一条染色体上HLA 各基因座的距离非常近，很少发生同源染色体之间的交换，在 HLA 遗传过程中，单倍型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代,子代HLA单倍型一个来自父亲，一个来自母亲。

HLA的单倍型遗传图 子1 子2 子3 子5 子4 (重组)

二.HLA遗传特征( Genetic characteristics) 2.单倍型遗传（haplotype）同胞之间HLA单倍型比较有3种可能性: • 有1/4机会HLA单倍型完全相同 • 有1/4机会HLA单倍型完全不同 • 有1/2机会一半相同，即共有一个单倍型

二.HLA遗传特征( Genetic characteristics) 3.连锁不平衡（linkage disequilibrium）处于 Hardy-Weinberg 平衡时，不同基因座的基因组成一个单倍型的频率等于各基因频率的乘积。实际群体调查发现：HLA 各基因座的基因并非完全随机组成单倍型，有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率，这种现象称为连锁不平衡。

二.HLA遗传特征( Genetic characteristics) 3.连锁不平衡（linkage disequilibrium）说明 HLA 不同基因座的基因之间存在关联，具有一同遗传的趋向。在法医物证学数据分析中，HLA 不同基因座的累积概率不能简单使用各基因频率的乘积，而应该用单倍型频率。否则会导致过高或过低估计HLA系统的鉴定能力。

三.HLA群体分布（Population distribution） 不同人群的 HLA 抗原分布有很大的差异，可能提供某些有关人类迁移和混杂的信息。对法医物证学数据分析而言，HLA 单倍型频率是计算法医物证学所需概率的依据。

第四节 HLA分型（HLA typing） HLA 分型方法可归纳为 3 类: • 微量淋巴细胞毒试验（血清学方法）:检测HLA-A、B、C、 DR 和 DQ 基因座的抗原； • 淋巴细胞培养试验（细胞学方法）:检测 HLA-D和DP基因座的抗原； • DNA分析：检测HLA所有等位基因。

三.DNA分型 HLA-DNA分型方法:针对核苷酸顺序差异而设计的，主要有四种方法: 1.PCR-RFLP分型方法 2.PCR-SSO分型方法 3. PCR-SSP分型方法 4.测序分型方法

（一）PCR-RFLP分型方法(PCR- restricion fragment lenth polymorphism) 利用组间特异性引物先扩增目的DNA片段，扩增产物再用多种限制酶消化，电泳分离获得 DNA 的多态性。关键：找到 HLA 某一位点与 HLA 其他位点不同的序列，但该序列是该位点所有等位基因共有的，用以设计组间特异性引物。然后用限制酶切割扩增产物并计算酶切片段长度。

（二）PCR-SSO分型方法 1.斑点杂交（Dot-Blot）原理：将PCR扩增产物变性后，直接点样于硝酸纤维素滤膜上，制成斑点，用等位基因特异寡核苷酸探针杂交，通过探针放射自显影进行HLA分型。特点：特异性强、结果稳定可靠。

2.PCR-微量滴度板杂交法（PCR-Microtiter Plate Hybridization， PCR-MPH）将 SSO 探针杂交检测转移到微量滴度板上完成，这种方法与酶联免疫吸附试验（ELISA）十分相似。先用一对带有生物素标记的引物对某一 HLA 基因座进行扩增。等位基因序列特异性探针则预先固相化在微量滴度板孔中，PCR 产物在孔中与探针发生特异性杂交，杂交产物带有生物素而能与亲和素结合，通过亲和素所带酶的底物反应显色，最终显示特异性杂交结果。

（三）序列特异性引物PCR（PCR-SSP分型）（PCR-Sequence- Specific Primers）原理：根据等位基因的序列，设计具有序列特异性的引物，对样本进行DNA分型。特点：以引物决定分型特异性，特异性强、重复性好、结果易于判定。

HLA-SSP分型结果

（四）DNA测序分型方法（sequencing） 原理：在 PCR 作组特异性扩增的基础上，采用荧光标记引物 PCR循环测序法，直接从序列上读取多态性信息，可消除其它分型方法的各种不确定性，最精确的分型方法。

四.血清学分型和 DNA分型方法可靠性比较 HLA 个体遗传差异的本质不是在于血清学方法所检测的抗原，而是在编码基因产物的 DNA 分子上。对 HLA 多态性的研究已由经典的血清学方法转向了 DNA分型。

第五节HLA的应用（The application of HLA） 一.法医学（Forensic medicine） 1.亲子鉴定（Paternity identification）特点：高度多态性；抗原频率很低；出生时抗原完全发育，且终生不变；按德尔定律遗传等。一般单测HLA血型，非父权相对机会可达90％。 2.个人识别（Personal identification）

二.器官、骨髓移植前的组织配型 （Organ、 bone marrow before transplantation tissue typing）三.某些疾病的病因研究、分类、诊断（Study on the etiology, classification, diagnosis）四.人类起源的探讨等人类学研究（Human origins of anthropological research）

复习思考题： 1.了解HLA命名的主要原则。 2.试述HLA的遗传特征。 3.试比较HLA血清学分型和DNA分型方法的可靠性。 4.单倍型。

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