GEN

1. GEN • ROZSZERZENIE DEFINICJI • NA WSZYSTKIE TRANSKRYBOWANE • SKEWNECJE DNA

2. POWSZECHNIE POD POJĘCIEM GENU ROZUMIE SIĘ SEKWENCJĘ DNA, SŁUŻĄCĄ JAKO INFORMACJA GENETYCZNA, TRANSKRYBOWANA DO KODUJĄCYCH BIAŁKO CZĄSTECZEK RNA ncRNAs

3. Typy RNA • KODUJĄCE • Wtranslacji (mRNA) • NIEKODUJĄCE • Regulatorowe RNA • W translacji (tRNA, rRNA) • W obróbce RNA • Genomy RNA • Wodwrotnej transkrypcji • Dwuniciowe RNA

4. niekodujące RNA • Endogenne siRNA (shortinterfering RNA) • miRNA (micro RNA) • Niekodujące „małe” RNA (ncRNA): • raRNA (repeat associated RNA) • piRNA (PIWI-interacting RNA)

5. Wyciszanie przy pomocy siRNA (SureSilencing™ siRNA Kits) SuperArray Simplicity

6. Co to jest siRNA Krótki interferujący RNA, lub w skrócie siRNA (ang. small interferingRNA), to krótkie dupleksy RNA o długości między 15, a 21 nukleotydów. Dupleksy te posiadają w obydwu niciach lepkie końce 3’ OH, a końce 5’ obydwu nici są fosforylowane. Po wprowadzeniu do komórek (transfekcji) siRNA przy pomocy komórkowej maszynerii atakuje cząsteczki informacyjnego RNA (mRNA) w miejscach, które mają identyczną sekwencję, po czym rozpoczyna się degradacja katalizowana przez odpowiednie enzymy. Degradowany mRNA nie służy już jako matryca dla translacji (biosyntezy białka) i w ten sposób ekspresja genu, z którego powstał ulega wyciszeniu. SuperArray Simplicity

7. Interferujący RNA (RNAi) odkryto pierwotnie u nicienia C. elegans. Po wstrzyknięciu długich odcinków dwuniciowego (ds.) RNA do gonady robaka (typowy sposób wprowadzania transgenów do robaków) blokowały one ekspresję edogennych genów zgodnie z ich specyficzną sekwencją. U eukariota większość genów kodujących białka jest transkrybowana przez polimerazę II, która syntezuje cząsteczki pre-mRNA obrabiane następnie do dojrzałych postaci mRNA. Dojrzałe cząsteczki mRNA są transportowane z jądra komórkowego do cytoplazmy, gdzie podlegają translacji. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

8. RNAi jest niedawno odkrytym mechanizmem regulacji endogennej ekspresji genów. U roślin regulacja za pośrednictwem RNAi jest uruchamiana przez kodowane w ich genomie krótkie regulatorowe RNA znane jako mikro-RNA. U glonów, robaków i much RNAi mogą być aktywowane przez mechanizm endogennej transpozycji. U roślin (a także w hodowanych komórkach owadzich) RNAi pełnią również rolę w obronie przeciw wirusom. Polega ona na atakowaniu wirusowych cząsteczek dsRNA przez enzymy mechanizmu wykorzystującego RNAi. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

9. Gdy cząsteczki długiego dwuniciowego (ds) RNA wnikną do komórki są one rozpoznawane i cięte przez czynnik białkowy o nazwie Dicer, który jest zaliczany rodziny RNAzy III endonukleaz swoistych wobec dsRNA. Cięcie przez Dicer tworzy krótkie dsRNA, które charakteryzują się dwunukleotydowymi wystającymi końcami 3’ z grupami –OH. Cząsteczki takie są nazywane krótki/mały interferujący (ang. small interfering) RNA. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

10. U robaków, much i ssaków siRNA mogą tworzyć kompleksy rybonukleoproteinowe zwane RISC (ang. RNAisilencingcomplex). Ten kompleks zawiera nukleazę o charakterze endonukleazy wytwarzającej 5' fosfomonoester RNA, którą nazwano także „Slicer” („Siekacz”). http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

11. RISC najpierw pośredniczy w rozwijaniu dupleksu siRNA. Jednoniciowy siRNA jest następnie przyłączany do RISC, a następnie łączy się z mRNA na zasadzie komplementarności zasad. To połączenie jest potrzebne do ustawienia mRNA w stosunku do „Slicera” celem przecięcia nici mRNA (miejsce cięcia znajduje się w środku sekwencji komplementarnej do przyłączonego siRNA). http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

12. Przecięty mRNA jest rozpoznany przez komórkę jako nieprawidłowy i ulega degradacji. Zapobiega to dalszej translacji, prowadząc do wyciszenia ekspresji genu, którego produktem jest degradowany mRNA. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

13. U roślin nieprawidłowy RNA powstający w wyniku rozcinania za pośrednictwem RISC może również służyć jako matryca zależnej od RNA polimerazy RNA (RdRp – ang. RNA dependent RNA polymerase) to syntezy nowych cząsteczek dsRNA. Proces ten polega na nie wymagającej starterów syntezie RNA, w której nieprawidłowy pocięty RNA służy jako matryca. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

14. Powstały w ten sposób dsRNA jest ponownie substratem dla Dicer’a, który wytwarza więcej cząsteczek siRNA. W niektórych organizmach z endogennym mechanizmem RNAi (np.: grzyby, rośliny, robaki i ssaki) RNAi występuje jeszcze inny etap z udziałem RNAi. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

15. W etapie tym jednoniciowe siRNA (nie związane z RISC) wiążą się do niszczonych mRNA w miejscach komplementarnych i służą jako startery dla RdRp do syntezy antysensownej nici RNA. Specyficzność tego typu jest wrażliwa na naturalną zmienność sekwencji. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

16. Cząsteczka dsRNA, która powstaje w tym procesie służy jako substrat dla Dicera, który rozcina ją na siRNA. Nowopowstałe siRNA mogą się rozdzielać do jednoniciowych i wtedy służą jako startery RdRp lub wraz z RISC pośredniczą w cięciu innych cząsteczek mRNA. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

17. Takie namnażanie połączone z rozsiewaniem RNAi między komórki (mechanizm na razie nie znany) jest prawdopodobnie podstawa przekazywania RNAi w liniach komórek rozrodczych u robaków. http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

18. Komórkowy mechanizm intereferencjiRNA. Długi dwuniciowy RNA (dsRNA) jest cięty, przez enzym zwany Dicer, na małe interferującecząsteczki RNA (siRNA).Tecząsteczki siRNAssą wbudowywane do indukowanego za pomocą RNA kompleksu wyciszającego (ang. RNA-inducedsilencingcomplex - RISC), w którym nici są rozdzielane. RISC zawierający nić wiodącą lub antysensową wyszukuje i wiąże się do komplementarnych sekwencji mRNA. Te sekwencje mRNA są następnie cięte przez Argonaute, który jest enzymemw RISC odpowiedzialnym za degradację mRNA, co skutkuje obniżeniem modulacji mRNA. A – adenozyna. Bumcrot, et al. NAT. CHEM. BIOL. 2:712(2006)

19. Chemiczne modyfikacje siRNAs. Pokazane są struktury cukrów, szkielet i modyfikacje zasad oraz konjugaty cholesterolowe. Bumcrot, et al. NAT. CHEM. BIOL. 2:712(2006)

20. Krytyczne pozycje nukleotydów w cząsteczkachsiRNA. Pokazane są nukleotydy ważne dla potencjalnego rozpoznawania mRNA, cięcia mRNA i swoistości cięcia, w tym minimalizacji niecelowanej degradacji. Bumcrot, et al. NAT. CHEM. BIOL. 2:712(2006)

21. Wykorzystanie siRNA W praktyce, zaprojektowanymi odpowiednio cząsteczkami siRNA atakującymi produkt wybranego genu można transfekować komórki, w których ma być zablokowana ekspresja tego genu. Wynik takiego zabiegu można wykrywać różnymi metodami biochemicznymi, molekularnymi i biologii molekularnej, które pozwalają zrozumieć znaczenie tego genu w biologii badanego obiektu. Próby wyciszania genów w schorzeniach o podłożu genetycznym SuperArray Simplicity

22. miRNA • Odkryty u nicienia C.elegans gen lin-4 hamujący gen lin-14 poprzez wiązanie z częścią 3’UTR mRNA (1993) • Kolejny odkryty gen kodujący miRNA to let-7 (2000), znaleziony u C. elegans, D. melanogaster, człowieka • Konserwatywne filogenetycznie, negatywne regulatory ekspresji genów

23. miRNA • Liczba poznanych genów miRNA rośnie i waha się w zależności od gatunku od 200 – 1000 (dla człowieka 470) – baza danych miRNA • Geny kodujące miRNA występują w intronach bądź w obszarach pozagenowych • Występują pojedynczo, bądź w policistronowych skupiskach • Ponad połowa genów miRNA człowieka mieści się w miejscach często ulegających amplifikacji, delecji, bądź rearanżacji w transformacji nowotworowej • Jeden rodzaj miRNA może wpływać na ekspresję wielu genów

24. Biogeneza miRNA • Transkryptpri-miRNA (primarymiRNA) ma długość kilkaset par zasad i z udziałem białka Drosha następuje wycięcie z niego fragmentu 70 nukleotydowego przypominającego szpilkę do włosów • Enzym Drosha tworzy kompleks z DGCR8 (DiGeorgesyndromeCritical Region 8) u ssaków • Następnie tak powstały pre-miRNA jest transportowany do cytoplazmy za pomocą białka Exportin-5, zależnego od GTP

25. miRNA • W dalszym etapie dojrzewania bierze udział enzym DICER, zależny od ATP, mający duże powinowactwo do dsRNA. • Enzym ten przecina pre-miRNA z jednej strony pętli niesparowanych nukleotydów tworząc przejściową, dwuniciową formę miRNA • Prawidłowe działanie enzymu DICER jest związane z łączeniem się w kompleks z białkiem towarzyszącym TRBP (HIV-1 TransactivatingresponseRNA-binding protein)

26. miRNA • Łańcuchy dojrzałych miRNA mają długość ok. 21-22 nukleotydów i są nietrwałe • Krótki okres półtrwania dupleksu miRNA wynika najprawdopodobniej z faktu że cząsteczki miRNA są szybko włączane do kompleksu RISC (RNA inducedsilencingcomplex), który zawiera m.in. białka rodziny Argonout

28. Mechanizm działania miRNA • Jeśli sekwencja miRNA jest wysoce komplementarna do 3’ UTR mRNA następuje degradacja transkryptu poprzez najprawdopodobniej rybonukleazę („Slicer”) w kompleksie RISC (zachodzi głównie u roślin) • Jeśli sekwencja miRNA jest mniej komplementarna wtedy kompleks RISC asocjuje z kompleksem blokującym połączenie się obu jednostek rybosomu i hamuje translację (spotykane głównie w komórkach zwierzęcych za wyjątkiem HOXB 8)

29. Rola miRNA • Sygnalizacja międzykomórkowa – miR-375 (specyficzny dla trzustki) hamuje wydzielanie insuliny • miRNA bierze udział w rozwoju, kontrolując np. geny HOX, rozwój układu nerwowego czy hematopoezy • miRNA wybiórczo występuje w zarodkowych komórkach macierzystych (ES) i może odpowiadać za ich możliwości samoodnowy ale i zdolności do różnicowania (w komórkach ES opisano ekspresję 36 miRNA z czego specyficznych wydaje się 15 z nich)

30. Rola miRNA • Zaburzenia ekspresji miRNA mogą przyczyniać się do rozwoju wielu chorób m.in. nowotworów • Mogą działać jako onkogeny jak i supresory

34. Różnice między siRNA, a miRNA • siRNA pochodzi z dsRNA, miRNA pochodzi z ssRNA • siRNA zazwyczaj w 100% jest komplementarny z transkryptem, miRNA nie jest w 100% komplementarny • prekursorysiRNA nie tworzą struktury szpilki do włosów • siRNA (23-27 nukleotydów) są fragmentami dłuższymi od mi RNA (21-21 nukleotydy)

35. lincRNAklasa RNA działających w obwodach kontrolujących pluripotentność i różnicowanie largeintergenic non-codingRNAs (lincRNAs)

36. lincRNA W genomie ssaków kodowanych jest wiele tysięcy długich niekodujących transkryptów:w tym klasa 3500 lincRNA zidentyfikowanych na podstawie charakterystycznych cech chromatyny w której zachodzi aktywna transkrypcja genów. Geny kodujące lincRNAposiadają interesujące właściwości, takie jak: zachowawczość ewolucyjna, ekspresja skorelowana z różnymi procesami komórkowymi oraz wiązanie kluczowych czynników transkrypcyjnych do ich promotorów. lincRNA oddziałują fizycznie z białkami regulatorowymi chromatyny.

37. lincRNA Dla kilku lincRNA, w badaniach typu utraty funkcji, wykazano że mają one wpływ na fenotyp komórki. Niektórzy podejrzewają, że geny lincRNAdziałają jedynie jako obszary wzmacniające, a transkrypty w postaci RNA, to wyłącznie przypadkowe produkty uboczne. Podobnie część badaczy uważa, że transkryptylincRNA działają jako aktywatory transkrypcji w układzie cis, a w układzie trans jako represory.

38. lincRNA W doświadczeniach typu knockdown wykazano, że: • wyciszenie ekspresji większości lincRNA w komórkach macierzystych typu zarodkowego(ES), miało silny wpływ na wzór ekspresji genów w komórkach ES,o wielkości porównywalnej do tej obserwowanej dla dobrze znanych białek regulatorowych w tych komórkach. • dziesiątki lincRNA w badaniach typu utraty funkcji powodowały wyjście komórek ze stanu pluripotencji, a • kolejne dziesiątki lincRNA, które wprawdzie nie sąniezbędne do utrzymania pluripotencji, działają jednak jako represory genów swoistych dla liniowo-specyficznych programów w komórkach ES.

39. lincRNA Należą do obwodów molekularnych w komórkach ES, ponieważ większość z nich jest bezpośrednio regulowana przez krytyczne połączone z pluripotencją czynniki transkrypcyjne. 30% lincRNA fizycznie oddziałuje ze specyficznymi białkami regulatorowymi chromatyny, oddziałując w ten sposób na ekspresję genów.

40. lincRNA Dotychczas uzyskane wyniki, ukazują sieć regulatorową w komórkach ES, poprzez którą czynniki transkrypcyjne regulują bezpośrednio ekspresją genów lincRNA, a spośród których wielemoże fizycznie oddziaływać z białkami chromatyny, wpływając na programy ekspresji genów i utrzymanie stanu pluripotencji komórek ES.

41. lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów • Pięć krótkich RNA o budowie spinki do włosów (ang. short hairpin RNA - shRNA) kodowanych przez konstrukcje na bazie lentiwirusów wycelowano przeciwko 226lincRNAwykrytym wcześniej w komórkach ES. • shRNA okazały się zdolne do redukcji ekspresji 147 lincRNA, średnio o około 75%,w porównaniu do ich zawartości endogennej w komórkach ES. • Każdy shRNA wprowadzono do komórek ES, z których po 4 dniach izolowano RNA i oznaczono całkowity profil transkrypcji, wykorzystując do tego mikromacierze cało-genomowe. • Jako znamienne zmiany ekspresji przyjęto te które przekraczały co najmniej 2x maksymalne wielkości wykryte w jakiejkolwiek z badanych kontroli negatywnych, a także cechowały się niskim stosunkiem wykrywalności błędów (ang. low false discovery rate - FDR) ocenianym dla wszystkich genów przy pomocy testów permutacji.

42. lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Schemat doświadczeń zaburzania lincRNA. Komórki ES infekowano shRNA, a stopień wyciszenia wyliczano i najlepszy shRNA wybierano do badań profili ekspresji metodą macierzy, a zróżnicowaną ekspresję genów obliczano w odniesieniu do negatywnej kontroli shRNA.

43. lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Przykładowe wyciszenie lincRNA. Góra: lokus genomowy zawierający lincRNA. Dół: mapa termiczna 95 genów objętych wyciszeniem badanego lincRNA.[Wskazana ekspresja kontrolnych shRNA (czerwono) i ekspresjalincRNAshRNA (niebiesko).]

44. lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Rozkład liczbowy genów dla wyciszonych 147 lincRNA (niebieskie) i 40 dobrze znanych białek regulatorowych w komórkach ES(czerwono). Wskazano pięć białek regulatorowych specyficznych dla komórek ES. Dla 137 spośród 147 lincRNA (93%), knockdown miał znamienny wpływ na ekspresję genów, obejmującśrednio 175 transkryptów kodujących białko, które podlegały wpływowi (zakres od 20 do 936).

45. lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Mimo, że niektóre pojedyncze lincRNA wydają się, przede wszystkim, hamowaćekspresję genu, to knockdown lincRNA w większości porównań powoduje zarówno aktywację, jak i represję porównywalnej liczby genów. Aby ocenić specyficzność obserwowanych działań zbadano profile z drugim najlepszym z walidowanych wstępnie shRNA,który wpływał na 10 losowo wybranych genów lincRNA. We wszystkich przypadkach, drugi shRNA skierowany przeciwko temu samemu celowi dawał znamiennie podobny rezultat w zmianach ekspresji. Wyniki te wskazują, że przeważająca większość lincRNAma porównywalne konsekwencje funkcjonalne w ogólnej ekspresji genów (w rozumieniu liczby genów i wpływu na wielkość ich ekspresji) znanych jako regulatory transkrypcji w komórkach ES.

46. lincRNA wpływają na ekspresję genów w sposób trans Wyniki knockdown: • tylko2 lincRNA miały wpływ na sąsiednie geny, • tylko 13 miało wpływ w zakresie 10 genów po obu stronach od miejsca ich położenia i • tylko 8 miało wpływ na geny położone nie dalej niż 300 kpz; Uzyskanewartości nie odbiegają od tych stwierdzonych dla genów kodujących białka.

47. lincRNA wpływają na ekspresję genów w sposób trans Wydaje się, że lincRNA oddziałują na ekspresję głównie w układzie trans.

48. lincRNA utrzymują stan pluripotentności Regulacja stanu komórek ES obejmuje dwie składowe: • Utrzymanie programupluripotencji i • represję programów różnicowania

49. lincRNA utrzymują stan pluripotentności Aktywność z promotora Nanogkierującego lucyferazą po stymulacji kontrolnymishRNA(czarne) lubshRNA dla lucyferazy (zielone), wybrane regulatory kodujące białka (czerwone), lincRNA (niebieskie).

50. lincRNA utrzymują stan pluripotentności Względne wartości ekspresji mRNAOct4 po knockdown wybranych genów kodujących białka (czerwone) i lincRNA (niebieskie) wpływających na natężenieekspresji Nanog-lucyferaza. Pokazano wyniki dla najlepszego shRNA(Hairpin 1) i drugiego dobrego (Hairpin 2). Wszystkie knockdownysą znamienne z wartością P<0.01 błąd standardowy dla (n=4).