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实验四 DNA 限制性 酶切 和琼脂糖凝胶 电泳

实验四 DNA 限制性 酶切 和琼脂糖凝胶 电泳. EcoR I Restriction Enzyme. 实验原理 --- 限制性内切酶及酶切反应. 识别序列 ------G ↓ AATT C ------ ------ C TTAA ↓ G ------. BamH I Restriction Enzyme. 识别序列： ------ G ↓ GATC C ------ ------ C CTAG ↓ G ------. Hind III Restriction Enzyme. 识别序列：

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实验四 DNA 限制性 酶切 和琼脂糖凝胶 电泳

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Presentation Transcript

  1. 实验四 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

  2. EcoR I Restriction Enzyme 实验原理---限制性内切酶及酶切反应 • 识别序列 ------G↓AATT C ------ ------ C TTAA↓G ------

  3. BamH I Restriction Enzyme 识别序列： ------ G↓GATC C ------ ------ C CTAG↓G ------ Hind III Restriction Enzyme 识别序列： ------ A↓AGCT T ------ ------ T TCGA↓A ------

  4. 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围： 7.5~8.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 温育温度：37℃

  5. 反应体系： DNA (1ug或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O10ul Total 20ul • 混匀，37度保温30分钟

  6. 实验原理---琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。 电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。

  7. 琼脂糖 • 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。

  8. 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

  9. 电泳法的优点 • 凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。 • 样品用量少。 • 设备简单。 • 可在室温进行。 • 操作简便，费时不多 • 不同类型的电泳，有不同的用途。 • 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。

  10. 试剂 1、TAE电泳缓冲液 Tris-base 冰醋酸 EDTA 2、琼脂糖凝胶（0.8%） 琼脂糖：0.8g TAE：100ml

  11. 3、溴化乙锭(ethidium bromide，EB) • EB染色液工作液浓度：0.01~0.03mg/ml • EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

  12. 4、6 x Loading Dye • 组成 0.25% bromophenol blue（深蓝色） 0.4% orange G （黄色） 10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTA • 使用量 5份DNA样品溶液加1份Blue / 6xLoading Dye

  13. 操 作 步 骤

  14. 一、酶切反应 • 反应体系： λ－DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul • 混匀，37度保温30分钟

  15. 二、电泳 。 1、电泳前的准备工作 轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。 2、制 胶(1)每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入 30ml电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化。（2)每组将琼脂糖液冷却到约70℃,轻轻倒入胶槽，并插 上梳子。凝固约30min. (3)取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。

  16. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3、点样和电泳 (1)将酶切产物、自制DNA与6 x Loading Dye混 合，每个样品混合后体积均为24ul。 a.自制DNA 20ul + 4ul Loading Dye b. 酶切产物 20ul +4ul Loading Dye (2)将标准λDNA /Hand III 、λDNA 、酶切产物、自制 DNA各10ul点入点样孔。 (3)电泳。 (4)EB染色10min。 （注意不要污染实验室环境）

  17. λ-DNA / Hind III Markers片段大小（ bp）和电泳带型示意图 点样孔 23130 9416 6557 4361 2322 2027

  18. 4、紫外分析仪下看胶 23130 9416 6557 4361 2322 2027

  19. 警告 EB（溴化乙锭）诱变！！！ • 胶染色和观察时一定要带手套！！！

  20. 结果记录与分析 • 绘制电泳图谱

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