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开题报告. 鼠李糖脂（ RL ）产生菌 O-2-2 的基因改造. 林福建. 天津大学化工学院. 2013-06-28. 一、 RL 的研究近况 二、 RL 代谢通路以及相关基因 三、发表文章中已使用的技术手段 四、拟开展工作 五、拟采用的技术路线. 一、 RL 的研究近况. 1 、国内外产业化现状. 2 、技术发展状况.
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开题报告 鼠李糖脂（RL）产生菌O-2-2的基因改造 林福建 天津大学化工学院 2013-06-28
一、RL的研究近况 • 二、RL代谢通路以及相关基因 • 三、发表文章中已使用的技术手段 • 四、拟开展工作 • 五、拟采用的技术路线
2、技术发展状况 发酵技术：发酵方式上有传统的液态发酵以及较为新的固态发酵、泡沫发酵等。采用生产菌种多为自行分离出的铜绿假单胞杆菌，野生菌产量与通过诱变、分子改造菌株相比较低。所选择的碳氮源为植物油和硝酸盐时RL产量提高。具体发酵工艺上，限制氮源浓度来获得最大产物产出率最常见，最佳C/N一般从8~52不等。发酵方法上研究最多的还是液态发酵，只是基于各个亚种的性状改变其发酵条件，如限制某些底物浓度，维持偏酸性的pH，流加操作提高发酵产量等。 德国专利最新报道新的铜绿假单胞菌种DSM7107和DSM可以生产高浓度的鼠李糖脂70~120g/L（96年）。最近没有高产鼠李糖脂的专利。
2、技术发展状况 分离技术：传统发酵液分离技术主要有离心分离、萃取分离和过滤分离。对于RL主要有两类分离方法：1）经典分离法：包括离心、沉淀、萃取等。通常步骤为离心除菌体后，用乙酸乙酯等有机溶剂萃取上清液。通过旋转蒸发蒸干溶剂即得到RL粗品。2）随程提取法：即在发酵的同时耦合分离工艺，包括泡沫分离、酸解聚沉、树脂吸附等。
二、RL代谢通路以及相关基因 此代谢通路中，关键步骤为RhlA（鼠李糖基转移酶1链A）催化下HAA的合成（β-羟基烷酰基-β-羟基烷酸）；RhlB（鼠李糖基转移酶1链B）催化下dTDP-L-鼠李糖作为糖供体，HAA作为受体的合成单糖双酯的反应；RhlC（鼠李糖基转移酶2）催化下在鼠李糖基的2号碳上连接一个鼠李糖从而合成双糖双酯的反应。 除此之外，dTDP-L-鼠李糖的合成在细菌细胞中原本就存在，HAA合成的前体物质合成也存在。并且不是影响RL合成的主要因素，因此这些步骤不需进行设计改造。
三、发表文章中已使用的技术手段 加拿大威尔夫大学Rahim等人在“Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2,an enzyme responsible for di-rahmnolipid biosynthesis”（01years）中提到：双糖双酯是在rhlC催化下在单糖双酯上再连接一个鼠李糖。rhlC是一个分子量为35.9kDa由325个氨基酸组成的蛋白质酶，为了确定RhlC的生物功能，经插入突变和等位置换获得的突变菌株RTII-2不能产双糖双酯但是能够产单糖双酯，同时获得PAO1-rhlA突变株（rhlA基因被破坏），其既不能产生单糖双酯又不能产生双糖双酯。经转入含有rhlC的质粒后的RTII-2则恢复了与野生型PAO1相同的产双糖双酯水平，并进一步研究了rhlC的操纵子的组成。
三、发表文章中已使用的技术手段 山东大学的李清心博士毕业论文“鼠李糖脂合成酶RhlA和RhlB基因的克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究”（2005年）：该文章分别将RhlA和RhlB用高表达的系统pET在大肠杆菌中进行了表达。其中，RhlA是一个分子量为33kDa的蛋白，在大肠杆菌内表达了含有6个组氨酸（His-tag）的重组RhlA蛋白，然后，通过亲和层析和FPLC分子筛层析的方法对其进行了纯化，并通过蛋白质印迹的方法，用特异性的检测6个组氨酸的单克隆抗体证明了所纯化的蛋白是正确的。 利用电转化的方法将含有RhlAB的pVLT质粒转入石油微生物P22和P8(石油环境中筛选所得)中，构建了高效产生鼠李糖脂的工程菌株，并通过RT-PCR分析了诱导后RhlA和RhlB在受体菌中的表达情况。实验发现，受体假单胞菌P22和P8在转入RhlAB基因后鼠李糖脂的产量都有较大提高，并且产量都明显高于铜绿假单胞菌的产量。 产量提高方面鼠李糖脂最高为3.8mg/ml，该论文主要是研究了在石油降解方面的作用产量提高不大。
三、发表文章中已使用的技术手段 山东大学的郝东辉博士毕业论文“采油微生物筛选、鼠李糖脂产酯性能及关键酶基因的克隆与表达研究”(08年）主要研究内容和结果如下： 1）产鼠李糖脂的原油降解菌的筛选与鉴定：以原油为唯一碳源和能源，从油田样品中分离筛选原油烃类降解菌SH6，并鉴定其为铜绿假单胞菌。利用TLC、IR分析验证其活性代谢产物为RL。 2）鼠李糖脂理化性质和乳化活性的研究。 3）碳氮源对RL生产的影响 4）鼠李糖脂转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达研究：对SH6的鼠李糖脂转移酶结构基因RhlAB和RhlABRI操纵子进行克隆与鉴定。构建含RhlAB和RhlABRI（RhlR和RhlI为调节因子）的重组质粒pSAOR2和pJDOR4，利用鼠李糖基转移酶自身启动子使其在大肠杆菌SM10、DH5α中进行表达。结果表明，只转入结构基因RhlAB的两种大肠杆菌产脂量均很低；而转入RHlABRI操纵子的两宿主产脂量均有提高，DH5α产脂量最高达105.2mg/L。这一产量在重组大肠杆菌表达鼠李糖脂的研究中仍是最高，而且可以避免使用IPTG带来的成本问题和操作麻烦。 5）质粒转移至采油微生物中：转入RhlABRI操纵子的采油菌产RL最高为101.8mg/L
三、发表文章中已使用的技术手段 台湾元智大学的魏玉红等人的“Enhanced di-rhamnolipid production with an indigenous isolate Pseudomonas aeruginosa J16”（08years）：通过13C核磁共振和质谱分析法在当地筛选得到一株产mono-RL（RL1）和di-RL（RL2）的铜绿假单胞菌J16，欲从培养基成份改进上尝试增加RL2的产量而相对减少RL1的产量，经碳氮源单一变量来测RL产量实验得到碳源为甘油、氮源为(NH4)2SO4时RL2的浓度和体积产率分别提高至2121mg/L和22.1mg/L，RL2/RL1为3.0。为了进一步增加RL2的产量，作者采用了统计学实验设计的方法优化培养基组成。选择三个主要的参数（甘油、 (NH4)2SO4和MgSO4.7H2O）进行三因素两水平设计，用RSM确定三因素的最优解。经最优培养基发酵，RL2的产量提高至最大浓度3190mg/L，体积产率为44.3mg/L，RL2/RL1比率为3.0。
三、发表文章中已使用的技术手段 除了上述研究方向外，大部分已发表文献主要研究了RL产生菌的筛选、发酵条件、工艺和分离的优化、利用废油等低成本原料生产RL、驱油及原油污染生物降解等方面。在这里不做一一阐述。
四、拟开展工作 介于RL的发酵分离工艺朱零青已经研究的比较成熟，所以拟从基因改造方面对已有RL产生菌O-2-2进行研究（山大研究最多），构建基因工程菌。从构建基因工程菌出发的优势有：1）现有的大多数产RL菌株的分子改造没有和RL的产量挂钩而是提高了其生物降解（石油降解）的能力或RL产量不高。2）O-2-2经发酵试验RL产量可达70g/L左右，在此基础上构建工程菌产量有望进一步提高，虽然构建方法上与已有文章相比无明显优势，但在产量上可以超越。3）双糖双酯RL2的表面活性比单糖双酯RL1的高，通过基因手段可以将rhlC操纵子转移至O-2-2中，提高RL2产量。 基因工程菌构建完毕再进行RL发酵分离工艺研究，参照朱零青的研究思路进行发酵，期以获得更高的RL产量。以此同时参照魏玉红的思路通过改变培养基成份的研究进一步提高RL2的产量。
五、拟采用的技术路线 相关文献报道，鼠李糖基转移酶1基因及其上下游序列约4600bp，包括14bp的鼠李糖基转移酶基因操纵子的启动子序列，888bp的rhlA结构基因序列，1281bp的rhlB结构基因序列，726bp的调节基因rhlR序列，616bp的调节基因rhlI序列。在每个基因序列上游都有该基因核糖体结合位点序列。所构建的表达质粒均不适用载体上的启动子而是使用目的基因自身启动子。并根据目的基因序列设计引物进行目的基因的扩增（两端需引入酶切位点）。 将纯化的PCR产物和克隆载体分别进行酶切，连接后转入E.coli感受态细胞。 rhlABRI质粒构建完成后再将rhlC(975bp)插入质粒。如下图：
五、拟采用的技术路线 Step1：The construction of plasmid rhlA 载体 rhlABRI rhlB rhlR RhlI rhlABRIC rhlC
五、拟采用的技术路线 Step2：Conversion to E.coli Step3: Clone and express of rhlABRIC in E.coli 对大肠杆菌进行培养并提取质粒酶切验证，确定rhlABRI成功连接到载体。 Step4: The construction of gene engineering strain 将含有rhlABRIC质粒的大肠杆菌导入铜绿假单胞菌O-2-2中，并同源整合到染色体上。 Step5: Productivity and proportion measurement of RL(di-RL in especial) 起初使用过滤、离心、萃取的方法实现RL的初步分离。然后再用层析的方法进一步提纯RL产品。并对样品进行分析确定其比例。
五、拟采用的技术路线 Step6: Optimization of medium to produce more di-RL 参照元智大学魏玉红等人的研究对培养基成份进行调整从而在高产基因工程菌基础上进一步提高di-RL的产量。
