БИОТЕХНОЛОГИЯ

1. НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОТЕХНОЛОГИЯ Часть 2. Фракционирование клеточных экстрактов

2. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ БИОСИНТЕЗА • После завершения процесса выращивания культуры продуцента получается система, содержащая наряду с целевым продуктом все остальные компоненты: остатки питательной среды, компоненты клеток микроорганизмов и продукты их метаболизма. Дальнейшие стадии процесса направлены на выделение из этой сложной смеси целевого продукта, что часто представляет собой достаточно сложную задачу и требует использования разнообразных технологических приемов.

4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ • Технологический процесс – совокупность и последовательность технологических процедур, приводящих к получению целевого продукта из исходного сырья. • При разработке промышленного технологического процесса важными являются некоторые критерии для сравнения эффективности процесса и его отдельных стадий.

5. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ Фазы процесса: I – фаза грубого фракционирова-ния; II – фаза основной очистки; III – фаза финишной очистки Обобщенное представление технологического процесса

6. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ Для сравнения специфичности отдельных стадий технологического процесса можно ввести величину – коэффициент специфичности: Этот коэффициент представляет собой отношение степени обогащения продукта на i+1-й стадии процесса к степени обогащения на предыдущейi-й стадии. При этом можно условиться, что специфичной считается стадия, для которой k ≥ 5. Эта величина выбрана, исходя из того, что три последовательных стадии с таким коэффициентом позволяют очистить продукт ~ в 100 раз.

7. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ • Полученная на стадии ферментации культура продуцента содержит целевой продукт либо в биомассе клеток (внутриклеточный продукт), либо в культуральной жидкости (внеклеточный продукт). • В любом из этих вариантов первой стадией фракционирования культуры является отделение клеточной массы от жидкой фазы – культуральной жидкости. • Разделение твердой (биомасса) и жидкой фаз сводится к задаче разделения суспензий.

8. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ • Задача разделения суспензий решается обычно методами седиментации. • Если представить себе систему в виде суспензии малых сферических частиц в жидкости, движение этих частиц может быть описано (приближенно) уравнением Стокса: u – скорость движения частиц; g – ускорение силы тяжести; D – диаметр частицы; η – вязкость дисперсионной среды ρ,ρ0 – плотность дисперсной фазы и дисперсионной среды соответственно

9. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ • Для малых частиц скорость седиментации в поле силы тяжести мала, тем более, что она снижается за счет броуновского движения. • В связи с этим седиментацию проводят в специальных аппаратах – центрифугах или сепараторах, в которых система помещается в центробежное поле, в котором ускорение свободного падения заменяется центробежным ускорением.

10. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Конструкции роторов центрифуг – проточные роторы: осветляющий (А) и сепарирующий (Б) Регулировочное кольцо Выход легкой фазы Легкая фаза Выход тяжелой фазы Тяжелая фаза А Б Осадок

11. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Попытаемся проанализировать работу проточной центрифуги. В режиме вращения жидкость располагается в роторе в виде цилиндра высотой h, внешним радиусом r2 и внутренним радиусом r1. Объем этого цилиндра, очевидно, равен Если мы будем подавать в ротор суспензию со скоростью Q(см3/с), то время пребывания в роторе объема суспензии Vравно t=V /Q, а путь, который преодолевает частица в радиальном направлении под действием центробежного поля, равен

12. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Далее: Видно, что первый сомножитель (Θ) в правой части этого уравнения определяется свойствами разделяемой системы (размер частиц, различие плотностей фаз, вязкость среды), второй (Σ) – параметрами центрифуги (объем и диаметр ротора, скорость его вращения).Этот критерий можно использовать при масштабировании процессов центрифугирования.

13. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В трубчатом роторе непрерывного действия частица перемещается в двух направлениях – вертикально, вдоль оси ротора вместе с потоком подаваемой суспензии, и радиально по направлению к стенке ротора – под влиянием центробежной силы. Для радиальной составляющей: Для вертикальной составляющей:

14. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Из этих уравнений Интегрируя полученное уравнение в пределах от r1 до r2(по r) и от 0 до h (по z), получаем: или

15. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Сопоставляя приведенные выше выражения, мы можем заметить, что величина Σ зависит только от параметров центрифуги и не зависит от природы разделяемой суспензии и может рассматриваться как критерий выбора режима и центрифуги.

16. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Градиентное центрифугирование Помимо конструктивных параметров центрифуги скорость осаждения может регулироваться путем подбора соотношения плотностей дисперсной фазы и дисперсионной среды. Этот способ оказывается пригодным для фракционирования клеточных органелл или даже макромолекул. Одним из вариантов использования этого принципа является центрифугирование в градиенте плотности растворителя. Если в состав растворителя ввести компонент, дающий растворы высокой плотности, то под влиянием центробежного поля в роторе центрифуги установится градиент концентрации этого компонента в соответствии с барометрической формулой Больцмана:

17. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Формирование градиента плотности. Утяжеляющие компоненты В качестве «тяжелых» компонентов могут использоваться соли, такие как CsCl (ρ = 1,905), Cs2SO4 (ρ = 1,80), RbCl (ρ= 1,35) и ряд других. В соответствии с уравнением для скорости движения частиц в поле сил в зоне, где плотность дисперсной фазы станет равной плотности среды, скорость станет равной 0, и движение частиц прекратится. Такая плотность растворителя называется плавучей плотностью для данного вещества. Частицы вещества, оказавшиеся в области раствора, где плотность растворителя превышает их плавучую плотность, всплывают в зону, где эти плотности становятся равными.

18. МАКСИМАЛЬНО ДОСТИЖИМЫЕ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ ГРАДИЕНТООБРАЗУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ

19. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Структура урограффина – смеси натриевой и 1-дезокси-1-(метиламино)-d-глюцитовой (метилглюцитовой) солей диатризоевой кислоты.

20. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Конструкции роторов центрифуг – проточный ротор препаративной лабораторной центрифуги

21. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Конструкции центрифуг – проточные роторы: тарельчатый

22. ЭТАПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ Центрифуга непрерывного действия с тарельчатым ротором. Разделяемая суспензия поступает в загрузочную линию сверху, попадает в нижнюю часть камеры и переходит в раздели-тельное пространство, наполненное кони-ческими тарелками. На врезке показано движение жидкой фазы и осадка, который собирается у стенки камеры и вытесняется в разгрузочный канал. Осветленная жидкая фаза поднимается в верхнюю часть камеры и выходит в выводной канал.

23. РАЗДЕЛЕНИЕ СУСПЕНЗИЙ ФИЛЬТРОВАНИЕМ Суспензии микробных культур могут быть разделены и с помощью фильтрования. Этот прием используется при стерилизации питательных сред и может быть использован при разделении суспензии микроорганизмов после культивирования. Важное различие: в процессах стерилизацииконцентрация клеток мала, так что большой нагрузки на фильтрующий материал не возникает. При разделении культуральной суспензииконцентрация клеток на много порядков выше. Кроме того, в случае отделения клеток от культуральной жидкоститребования к содержанию микробных клеток в фильтрате менее строги, чем при стерилизации.

24. РАЗДЕЛЕНИЕ СУСПЕНЗИЙ ФИЛЬТРОВАНИЕМ Конструкции фильтров довольно разнообразны. Существуют фильтры, работающие под вакуумом, под давлением, существуют фильтрующие центрифуги, в которых раствор продавливается через цилиндрическую фильтрующую перегородку действием центробежной силы. Важным обстоятельством, снижающим производительность работы фильтрующих аппаратов является возрастание сопротивления потоку жидкости через фильтрующую перегородку по мере накопления слоя осадка на поверхности фильтра. Происходит также «забивание» пор фильтрующего материала, также приводящее к снижению скорости протока через фильтрующую перегородку.

25. РАЗДЕЛЕНИЕ СУСПЕНЗИЙ ФИЛЬТРОВАНИЕМ Поток фильтруемой суспензии Слой осадка; заметен градиент плотности По мере накопления осадка слой его становится толще, а давление со стороны потока уплотняет осадок. Сопротивление потоку растет. Наблюдается явление концентрационной поляризации фильтра.Наиболее сильно проблемы заметны, когда направление фильтрации перпендикулярно плоскости фильтра. Проблемы устраняются перемешиванием объема перед фильтрующей перегородкой и созданием тангенциального потока суспензии по отношению к фильтрующей поверхности

26. РАЗДЕЛЕНИЕ СУСПЕНЗИЙ ФИЛЬТРОВАНИЕМ Ротационный вакуум-фильтр со шнуровым съёмом осадка.

27. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ЭКСТРАКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ • После отделения биомассы продуцента от культуральной жидкости начинается процесс очистки целевого продукта, который содержится либо в клеточной массе, либо в культуральной жидкости. • В обоих случаях исходной является весьма сложная многокомпонентная смесь различных по своей природе соединений, задача разделения которых всегда достаточно сложна. • Особенно сложна задача разделения белковых компонентов, которые представляют собой достаточно близкие по химической природе соединения – полимеры аминокислот, так что различия в их свойствах, на которых можно строить стратегию фракционирования, относительно невелики.

28. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ЭКСТРАКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ • Если продукт находится в культуральной жидкости (внеклеточный продукт), можно сразу переходить к ее фракционированию. • Если продукт находится в составе биомассы (внутриклеточный продукт), необходимо предварительно разрушить клетки (процедура дезинтеграции), чтобы получить некоторый раствор, из которого далее можно выделять продукт.

29. ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Дезинтеграция клеточной массы, равно как и органов и тканей животных и растений представляет собой один из важнейших элементов биотехнологического процесса. • Эту процедуру осуществляют либо физическими, либо химическими, либо ферментативными методами. Встречаются случаи, когда используются и комбинации этих приемов.

30. МЕХАНИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Наиболее распространенными в промышленности являются физические методы, среди которых, в свою очередь, чаще всего применяются баллистические методы дезинтеграции клеточной массы. Сущность этой группы методов состоит в том, что биомассу подвергают воздействию удара или истирания. • В первом случае биомассу помещают в цилиндрический барабан, вращающийся вокруг оси и наполненный шариками из тяжелого твердого материала (металл или фарфор). При вращении барабана шарики перекатываются и ударяют по агломератам биомассы, причем эти удары происходят достаточно часто и в разных направлениях. В конце концов, это приводит к разрушению клеточных стенок и получению сравнительно однородного вязкого раствора, в котором находится содержимое клеток.

31. МЕХАНИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Механическая дезинтеграция: вращающийся барабан с рубашкой для охлаждения. • В барабан загружены шары из твердого материала (керамики), а затем загружается разрушаемая биомасса. • При вращении барабана происходит раздавливание клеток за счет столкновения с шарами, которые вращаются вокруг собственных осей, падают сверху на частицы биомассы. • При таких соударениях и трении происходит разогрев содержимого барабана, что приводит к необходимости охлаждения, чтобы избежать термоинактивации компонентов клеточного экстракта.

32. МЕХАНИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Ход дезинтеграции в протоке можно описать уравнением: • где A - степень дезинтеграции, % • K - константа скорости дезинтеграции, • f- объемная скорость, л/час. • По этому уравнению можно рассчитывать: • Степень дезинтеграции при заданной скорости протока; • Скорость протока, обеспечивающую заданную степень дезинтеграции • Величина К определяется природой разрушаемых клеток

33. МЕХАНИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Другим способом механической дезинтеграции клеток является экструзия. Сущность этого способа заключается в том, что суспензию клеточной массы под высоким давлением (до 100 ати) продавливают через узкое отверстие в камеру с нормальным давлением. При этом из-за большого перепада давления вода, попавшая под действием высокого давления в клетки, быстро выходит из них и разрушает клеточную стенку. При создании высокого давления и продавливании суспензии через узкое отверстие происходит разогрев, так что во избежание потерь продукта из-за термоинактивации и в этом случае необходимо охлаждение суспензии. Степень разрушения клеток при таком способе составляет до 90%. • В лабораторной практике применяется способ разрушения клеток, основанный на чередовании быстрого замораживания и оттаивания клеточной массы. При этом вода, входящая в состав клеток, замерзает, образовавшиеся частицы льда, превосходящие по объему воду в жидком состоянии, разрывают клеточную стенку. Повторение таких процедур несколько раз приводит к достаточно полному разрушению клеточных стенок.

34. УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Помимо механических способов разрушения клеток, используются приемы, основанные на воздействии на клетки ультразвука. Под действием ультразвукового поля клетки испытывают попеременные сжатия и растяжения, скручивание в различных направлениях, что, в конце концов, приводит к разрыву клеточной стенки и разрушению клетки. • Как и в случае баллистических методов, операция дезинтеграции с помощью ультразвука может осуществляться как в периодическом, так и в непрерывном (проточном) режиме. Для этой цели сконструированы специальные ячейки, позволяющие прокачивать суспензию разрушаемой биомассы (со скоростью до нескольких литров в минуту при концентрации клеток в суспензии до 20 %) и поддерживать при этом температуру не свыше 2–4oС. Степень разрушения и в этом случае оценивается по выходу белка в раствор и составляет до 60 % за один цикл. Для более полного разрушения биомассу можно возвращать в цикл.

35. УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Кинетика выделения белка в раствор описывается уравнением где x– доля перешедшего в раствор белка от общего его количества в клетках, k– константа скорости выделения белка в раствор (в пределах 20–60% не зависит от концентрации клеток в суспензии). Для проточного аппарата такая зависимость имеет вид: где kv – константа скорости выделения белка для камеры объемом V; xeq– доля перешедшего в раствор белка в равновесном состоянии; y – скорость протока суспензии клеток через ячейку.

36. ХИМИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • Иногда более удобным оказывается разрушение клеточной оболочки за счет перевода в раствор отдельных ее компонентов – изменения ее состава и структуры, что делает ее более проницаемой для клеточного содержимого. • Одним из таких методов является детергентный лизис клеток. Биомасса продуцента обрабатывается каким-либо из детергентов, который растворяет липидные компоненты клеточной стенки, после чего внутриклеточное содержимое через образовавшиеся поры вытекает в окружающую среду. • Подобный процесс также может проводиться в непрерывном режиме.

37. ХИМИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • В аппарат 1 загружается суспензия биомассы в растворе литического агента. Этот аппарат является резервуаром, из которого суспензия попадает в теплообменник 2, где подогревается до температуры, при которой происходит лизис (в аппарате 3). После пребывания в реакторе 3 суспензия попадает в другой теплообменник, где она охлаждается – во избежание длительного пребывания при повышенной температуре, что может привести к разрушению целевого продукта. • Время контакта биомассы с литическим агентом задается скоростью прокачивания суспензии через систему и рассчитывается, исходя из скорости лизиса данной биомассы данным литическим агентом. 1 2 3 2 1- резервуар с суспензией биомассы в растворе литического агента 2 – теплообменники 3 – реактор для экстракции

38. ХИМИЧЕСКАЯ ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ • В качестве литических агентов используются детергенты, но по аналогичной схеме могут использоваться и ферменты, разрушающие клеточные стенки продуцента. • Известны ферменты, пригодные для лизиса клеток различных микроорганизмов. В случае бактерий часто используют лизоцим куриных яиц, который расщепляет гликопротеидный каркас клеточных стенок. Наиболее приемлемо использование лизоцима для разрушения клеточных стенок грам-положительных бактерий, однако и грам-отрицательные бактерии в достаточной степени восприимчивы к действию лизоцима. • Клетки дрожжей к лизоциму устойчивы, так что приходится применять другие ферменты. Такие ферменты найдены, они продуцируются бактериями и могут с успехом использоваться как наиболее щадящие литические агенты для сохранения лабильных внутриклеточных продуктов.

39. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ Наиболее сложным представляется разделение белковых компонентов клеточного содержимого. Причина в сложности и полифункциональности белковых молекул и в их гетерополимерной природе, создающей условия для внутримолекулярной подвижности отдельных сегментов молекулы друг относительно друга, что приводит к возможности возникновения близких по энергии, но сильно отличающихся по функциональным возможностям состояний. Схематическое изображение белковой молекулы в растворе. Видны спиральные фрагменты, элементы β-структуры, гидрофильные и гидрофобные участки молекулы, диполи воды во взаимодействии с белковой глобулой.

40. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ При сближении друг с другом частицы белка, окруженные гидратной «шубой» и ионной атмосферой Белковая глобула в растворе представляет собой аналог коллоидной мицеллы. На поверхности глобулы формируется двойной электрический слой, со стороны раствора возникают плотная и диффузная части двойного слоя. Потенциал, приходящийся на диффузную часть, называется электрокинетическим потенциалом. Диффузная часть образует ионную атмосферу.

41. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ Задача разработки процедуры очистки белка из столь сложной смеси состоит в использовании малых различий в свойствах белков для их разделения. Ионная атмосфера и гидратная оболочка формируют энергетический барьер, препятствующий слипанию белковых глобул при их сближении. Ионная атмосфера вызывает взаимное электростатическое отталкивание частиц при их сближении. Гидратная оболочка препятствует взаимодействию поверхностей белковых глобул за счет насыщения энергии полярных и ионных группировок взаимодействием с дипольными молекулами воды. U φ - потенциал кинетического барьера r

42. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ • Распределение зарядов и полярных групп на поверхности разных белков существенно различается. • Доля заряженных группировок зависит от рН среды. • Радиус ионной атмосферы зависит от ионной силы раствора. • Прочность гидратной оболочки зависит от диэлектрической постоянной раствора.

43. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ • Все эти параметры влияют на величину энергетического барьера слипания, для разных белков условия преодоления барьера наступают при разных обстоятельствах, что и позволяет фракционировать белковые смеси. • Белки различаются по величине изоэлектрической точки – значении рН, при котором суммарный заряд белковой глобулы равен 0. При этом барьер слипанияпреодолевается довольно легко, частицы начинают агрегировать, белок выпадает в осадок. • При повышении ионной силы раствора двойной слой сжимается, электрокинетический потенциал понижается. Это также приводит к снижению барьера слипания и к агрегации белковых частиц с образованием осадка. • При добавлении в среду органических растворителей понижается диэлектрическая постоянная, что также способствует снижению барьера и агрегации белковых частиц.

44. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ • На этих принципах основано фракционирование белковых смесей ступенчатым солевым осаждением. В качестве осадителя чаще всего используют сульфат аммония, который не вызывает денатурацию белков и способствует длительному сохранению их активности в осадке. • При разработке технологии фракционирования белковых экстрактов осаждением сульфатом аммония к раствору добавляют твердую соль порциями, медленно, с осторожным перемешиванием при пониженной температуре. Концентрацию сульфата аммония выражают в долях от концентрации насыщенного раствора (степень насыщения). Первую порцию добавляют до момента помутнения раствора, оставляют до созревания осадка при пониженной температуре (на несколько часов), осадок отделяют центрифугированием, затем добавляют новую порцию соли до момента помутнения, далее проводятся те же операции, пока не будет достигнута насыщающая концентрация раствора сульфата аммония. • Получают серию осадков, в которых определяют концентрацию (активность) целевого продукта.

45. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ • Аналогичным образом проводится разработка технологии фракционирования белковых смесей селективным осаждением органическими растворителями. В качествеосадителей используют этанол, ацетон, изопропанол и др. растворители. • К сильно охлажденному раствору добавляют растворитель порциями, медленно, с осторожным перемешиванием при пониженной температуре. Первую порцию добавляют до момента помутнения раствора, оставляют до созревания осадка при пониженной температуре (на несколько часов), осадок отделяют центрифугированием, затем добавляют новую порцию растворителя до момента помутнения, далее проводятся те же операции, пока не будет достигнута концентрация раствора, при которой осаждаются все содержащиеся в смеси белки. • Поскольку органические растворители вызывают денатурацию белков, перед добавлением новой порции растворителя смесь охлаждают до возможно более низкой вплоть до отрицательных значений температуры, что возможно из-за понижения температуры замерзания раствора за счет добавок органического растворителя. • Помимо органических растворителей в качестве осадителей могут использоваться водорастворимые полимеры.

46. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ lgM 6.0 5.0 4.0 Фосфорилаза Пируваткиназа Альдолаза Лактатдегидрогеназа Энолаза Креатинкиназа ФосфоглицераткиназаМиокиназа Миоглобин Парвальбумин Приблизительные области осаждения некоторых белков из экстрактов мышц различными концентрациями ацетона при 5° С, рН 6,5, I = 0,1 20 40 60 80 Концентрация ацетона, % (v / v)

47. АФФИННОЕ ОСАЖДЕНИЕ • Для повышения эффективности осаждения могут применяться аффинные методы. В случае, например, ферментов, связывающихся с нуклеиновыми кислотами (ДНК-полимераза 1, РНК-полимераза из E. сoli) при осаждении НК катионными агентами происходит соосаждение ферментов. В других ситуациях аффинные процедуры можно конструировать на основе информации о свойствах фермента. • При очистке ферментов, способных связываться с полисахаридами, предложено использовать в качестве осадителя альгиновую кислоту. Фермент связывается с этим осадителем, а затем в раствор добавляют соль кальция, с которым альгиновая кислота образует гель, выпадающий в осадок вместе со связавшимся с ним ферментом. • После отделения от раствора к осадку добавляют ЭДТА, которая связывает ионы Са, гель растворяется и фермент освобождается из комплекса.

48. АФФИННОЕ ОСАЖДЕНИЕ Аффинное осаждение амилазы из проростков пшеницы: Дорожка 1 – сырой препарат (экстракт проростков) Дорожка 2 – очищенный препарат Количество белка на геле одинаковое; Элюция мальтозой. Альгиновая (поли-D-ман-нуроновая) кислота M. Sardar & M. N. Gupta. Alginate beads as an affinity material for alpha amylases// Bioseparation 7: 159–165, 1998.

49. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ • Одним из такого рода приемов является распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкими фазами, использующееся в технологии так называемого противоточного распределения, в ходе которого осуществляется последовательное многократное распределение вещества между двумя жидкими фазами. - коэффициент распределения Состав фаз подбирается таким образом, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси были удобными для разделения

50. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ Устройство для противоточного распределения состоит из множества ячеек (1,2,3 на схеме), в которые залита «тяжелая» неподвижная фаза. В ячейку 1 заливают «легкую» подвижную фазу, вводят разделяемую смесь, встряхивают полученную систему, дают расслоиться. Осуществлено первое распределение – компонентов смеси между фазами в соответствии с коэффициентами распределения. Затем подвижная фаза переносится из ячейки 1 в ячейку 2 – первый перенос. Далее операции распределения повторяются, производится перенос в ячейку 3 и процесс продолжается.