Elektroosmotický tok EOF

1. Elektroosmotický tok EOF Fyzický tok kapaliny kapilárou, který je vyvolaný vložením stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody a je důsledkem vlastností fázového rozhraní mezi pohyblivou (kapalnou) částí a nepohyblivou (vnitřní stěna kapiláry) částí kapiláry. Objem kapiláry = několik ml Průtokové rychlosti jsou velmi malé, řádově ve stovkách až tisích nl/min. Elektroosmotický tok zde plní podobnou úlohu jako pumpy v HPLC, ale pro vlastní separaci je někdy výhodné EOF potlačit. Základní výhodou EOF je plošný profil toku kapaliny v kapiláře, který je dán malými vnitřními rozměry kapiláry

2. Plošný profil EOF HPLC, CZE s potlačeným EOF CZE

3. Přibližný model vzniku EOF Kapilára pro separaci je vyrobena z taveného křemene. Na vnitřním povrchu kapiláry jsou situovány tzv. silanolové skupiny 1. Vodné prostředí (pracovní elektrolyt) hydratuje silanolové skupiny, jejich „kyselý“ vodík může v závislosti na pH vodného prostředí disociovat -SiOH + H2O -SiO- + H3O+ 2. Disociací vznikne na vnitřní stěně kapiláry přebytek záporného elektrického náboje, který je okamžitě kompenzován stejně velkým nábojem kationtů přítomných v pracovním elektrolytu. Tyto kationty jsou k záporně nabitým silanovým skupinám silně přitahovány, takže se stanou součástí vnitřní stěny kapiláry a vzniká nepohyblivá Sternova elektrická dvojvrstva. K této nepohyblivé dvojvrstvě jsou přitahovány ionty z volného pracovního elektrolytu v těsné blízkosti dvojvrstvy uvnitř kapiláry, ale tyto již nejsou poutány velkou elektrickou silou a mohou migrovat v elektrickém poli (tvoří tzv. difuzní dvojvrstvu)

4. 3. Vložením stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody, začnou kationty migrovat směrem ke katodě a zároveň budou odpuzovány od kationtů, které jsou umístěny v nepohyblivé dvojvrstvě. Protože kationty migrují směrem ke katodě i se svými solvatačními (hydratačními obaly) dochází k pohybu celé kapaliny uvnitř kapiláry směrem od anody ke katodě.

5. Důsledky EOF na migraci iontů • EOF se pohybuje směrem od anody ke katodě v případě klasické křemenné kapiláry bez modifikace vnitřního povrchu. • EOF je silně závislý na pH, složení a koncentraci pracovního elektrolytu, dielektrické konstantě použitého rozpouštědla a viskozitě elektrolytu • EOF unáší směrem ke katodě jak kationty, tak neutrální látky tak i anionty a umožňuje tak provést separaci kationtů i aniontů zároveň. Neutrální látky separovány nejsou tvoří společnou zónu. • EOF může separaci urychlit • příliš rychlý EOF může separaci zhoršit • EOF zprostředkovává pohyb nenabitých neionizovaných aditiv pracovního elektrolytu (např. nativní cyklodextriny).

7. Vliv proměnných parametrů na EOF

8. Měření mobility EOF • Měření EOF probíhá nejčastěji s využitím tzv. „EOF markerů“ • Neutrální molekula rozpustná v prostředí pracovního elektrolytu. • Neměla by interagovat pokud možno s analyty ani se složkami pracovního elektrolytu. • Měla by být snáze detekovatelná. Benzen, mesityloxid (4-methyl-3-penten-2-on), aceton, močovina, krotonaldehyd (2-butenal) = všechny tyto markery jsou použitelné pro UV detekci případně pro vodivostní detekci. Marker migruje stejnou rychlostí jako se kapilárou pohybuje EOF a unáší všechny neutrální látky, proto musí být marker EOF rovněž neutrální. V některých případech postačí jako EOF marker voda obsažená v dávkovaném vzorku která se v UV oblasti projeví jako negativní pík na základní linii Z elektroforegramu se odečte migrační čas EOF markeru a mobilita se vypočítá.

10. Hydrodynamické dávkování

11. Běžně se v kapilární CE technikách dávkuje řádově v nanolitrech = CE by mohla být poměrně velmi citlivou metodou. • ALE: Např. pro on-line UV detekci platí Lambert-Beerův zákon • A = .l.c • …. Molární dekadický absorpční koeficient l…. Délka optické dráhy c…látková koncentrace Pro on-line UV-Vis detekci je délka optické dráhy rovná průměru kapiláry tedy pouze desítky mm „Sample overloading“ = v praxi se nastřikuje zóna vzorku ne delší než 1-2% celkové délky kapiláry

12. Spojení CE-MS Citlivá detekční a identifikační technika, univerzální detekce Technické problémy při spojení a rutinních analýzách.

13. Schéma komerčního spojení CE s ortogonálním ESI-MS

14. CE lze on –line spojit s MS jako kapalinovou separační techniku s měkkými ionizačními technikami: ESI = ionizace elektrosprejem APCI = chemická ionizace za atmosférického tlaku CE lze off-line spojit s ionizací desorpcí laserem (MALDI ionization) pro analýzu biomakromolekul. CE-ESI, CE-APCI – analýza nízkomolekulárních látek a látek se střední molekulovou hmostností (fragmenty peptidů, fragmenty DNA) CE-MALDI – analýza vysokomolekulárních látek a látek se střední molekulovou hmostností.

15. Analýza drog CE-ESI-MS

16. Elektroferogram, kvantitativní a kvalitativní analýza Rozlišení, kvantitativně popisuje míru separace dvojice analytů. Čím je rozlišení větší, tím budou od sebe dvě složky lépe separovaný. V praxi se snažíme dosháhnout rozlišení 1,5 nebo většího V CE technikách je separace primárně řízena účinností nikoli selektivitou jak je tomu u chromatografických technik. Postačí tedy velmi malá diference v mobilitách (<0,05% v mnoha případech), pokud máme dostatečně velkou účinnost píků (tj. řádově 104 až 105. Rozlišení vyjádřené pomocí mobilit separovaných částic

17. Migrační čas odpovídá kvalitativní charakteristice analytu Plocha (výška) píku odpovídá kvantitativní charakteristice